单细胞测序前的3大关键问题，您都处理对了吗？
在无数实战经验中，制备高质量的单细胞悬液被公认为重中之重。实验过程中，如单细胞活性不高，细胞数过低，以及污染和杂质等问题，都会影响到有效单细胞数的产出、单细胞核酸的质量等，最终得到的单细胞数据分析及统计结果不可信。
那么，组织如何解离？需要选什么酶？还需要注意什么？科技君根据相关权威文献整理了单细胞悬液制备的方法和小贴士，让我们一起来解决单细胞研究方案中的拦路虎。
一、实体组织解离关键——酶的合理选择
实体组织解离两大步骤，包含机械分离和酶消化处理。
首先，组织需要通过物理切割或刀片切碎，然后通过酶消化来分离细胞。特定的组织消化酶及消化时间不同，相关建议可参考如下表格：人和小鼠的部分组织类型——肝脏、肺、皮肤、脾脏、消化道、胰腺、肾脏、视网膜等[1]。
表1 人鼠各类型组织酶解单细胞悬液方法总结[1]
除此之外，常用酶的类型还包括：AccutaseTM、弹性蛋白酶和胶原酶，以及商业酶混合物，如 TrypLE Express 和 Liberase Blendzyme 等[1]，当然也可以选择美天旎品牌的各类组织解离试剂盒。
另外，科技君也总结已发表文献中常见实体组织解离所采用的酶，供大家参考，步骤详见参考文献：
小鼠心脏肌肉组织：Collagenase IV and Dispase II[2]
上皮组织：dispase(Corning) -商业化试剂[3]
小鼠胚胎组织：TrypLE Express[4]
乳腺癌及其癌旁组织: Liberase TL (Sigma) -商业化试剂[5]
小鼠主动脉血管：Collagenase type II (C6885, Sigma Aldrich) 和 Elastase (LS002292, Worthington Biochemistry)[6]
小鼠脑垂体：Collagenase type II, trypsin， DNase I，amphotericin B 混合[7]
二、血液处理成关键——离心稳定操作[1]
样品经过密度离心(例如使用Ficoll-Paque或Histopaque-1077技术)，可以直接用于外周血单核细胞（PBMC）捕获[1]。
建议不少于5mL EDTA 抗凝血，且不要使用肝素抗凝管收集血液；同时注意在合适转数离心操作后，管中内容物分为三层，上层为血浆（内含细胞碎片），中间层为分层液，底层为红细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单核细胞层（ 白膜层，薄）。此时，需使用无菌吸管小心沿离心管壁周缘吸取界面层单核细胞后，再加入HBSS /PBS重悬。更多注意事项请参见华大科技单细胞送样建议。
三、单细胞悬液制备的8条建议[1]
1. 建议采用无菌样品处理方式，包括使用不含核酸酶的试剂和耗材。
2. 为降低对细胞的损伤，移液和离心应保持在最低程度。在一定的离心速度、时间和温度下，细胞浓度和大小直接影响制备的效率。
3. 在进行细胞清洗和重悬过程中，使用具有合适大小的器皿，避免高浓度导致细胞集聚和结块，请注意选择。
4. 应使用适当大小的细胞过滤器过滤悬浮液，孔径大于细胞直径，以去除团块和碎片。
5. 细胞清洗和复苏，推荐使用含牛血清的磷酸盐缓冲盐水(不含钙和镁)，减少细胞损失和聚集的白蛋白。
6. 细胞裂解升高可导致细胞团块形成，在细胞分离过程中，DNase I可减少细胞团块形成。
7. 细胞团块会导致自动细胞计数器低估单个细胞的有效浓度，因此制备后应尽快处理悬浮液，最好在30分钟内处理。
8. 总之，在单细胞制备中，尽可能减少细胞聚集物、死亡细胞、非细胞核酸和逆转录(RT)抑制剂是非常重要的。为了在最大限度地提高不同细胞类型的纯度和无偏回收率的同时，最小化这些污染物，可能需要应用优化，例如，调整洗涤步骤的数量、洗涤溶液的组成、离心条件和/或过滤器类型。
华大科技开启国内单细胞研究先河，10年研究服务技术沉淀，为您提供全方位的单细胞研究服务。
参考文献：
[1] Lafzi, Atefeh, et al. "Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies." Nature protocols (2018): 1.
[2]Skelly, Daniel A., et al. "Single-cell transcriptional profiling reveals cellular diversity and intercommunication in the mouse heart." Cell reports 22.3 (2018): 600-610.
[3]Cheng, Jeffrey B., et al. "Transcriptional programming of normal and inflamed human epidermis at single-cell resolution." Cell reports 25.4 (2018): 871-883.
[4]Pijuan-Sala, Blanca, et al. "A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis." Nature 566.7745 (2019): 490.
[5]Azizi, Elham, et al. "Single-cell map of diverse immune phenotypes in the breast tumor microenvironment." Cell 174.5 (2018): 1293-1308.
[6] Hadi, Tarik, et al. "Macrophage-derived netrin-1 promotes abdominal aortic aneurysm formation by activating MMP3 in vascular smooth muscle cells." Nature communications 9.1 (2018): 5022.
[7] Cheung, Leonard YM, et al. "Single-cell RNA sequencing reveals novel markers of male pituitary stem cells and hormone-producing cell types." Endocrinology 159.12 (2018): 3910-3924.
