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基于BD Rhapsody高通量单细胞RNA-Seq
基于BD Rhapsody平台，实现高通量单细胞分选和单细胞mRNA建库，主要原理依据微孔法，实现高通量的单个细胞及无偏差3’端- mRNA捕获、扩增和检测，完成高效的mRNA反转录和扩增后进行高通量测序，结合华大DNBSEQTM高通量测序平台，实现单细胞基因表达研究，细胞类型解析，及细胞异质化研究等。针对合作伙伴提供的细胞，提供高质量细胞分选及RNA-Seq测序服务。
产品优势
- 一次性获得高通量单细胞：细胞数量至多2万个，细胞分群更准
- 实验质控严格：4次实时可视化监控，直观展现细胞捕获动态，有效保证实验成功率
- 样本分选设计灵活：根据实验需求，单细胞多样本分选模式任您选择
- 一站式单细胞解决方案配套：从目的细胞解离、富集、分选到流式分选细胞验证，一站式解决，避免细胞失活风险
- 测序数据高保真：搭配DNBSEQ测序系统，不累计扩增错误，无数据拆分错误烦恼
- 上门服务及时高质：仪器体积轻便，随项目而动*来自细胞系单细胞测序数据
产品类型
流式细胞分选搭载BD单细胞分选平台
- 旗舰版：高通量单细胞分选模式——2万个单细胞/样本
- 简约版：多样品低通量单细胞分选模式——5000个单细胞/样本（人、鼠免疫细胞）
* 以上版本均包含建库测序分析，细胞得数及数据量上下浮动20%，根据具体项目单细胞质量等问题，结果有差异
技术原理
基于BD Rhapsody平台的高通量单细胞RNA-Seq是结合微孔板技术，利用自然沉降的原理分离单细胞，将带有CL（Cell Label）、UMI（Unique Molecular Index，分子标签）、Poly-dT的磁珠与单细胞混合，从而实现大规模的单细胞mRNA捕获，以用于后续的文库构建。
图1 细胞分选&mRNA捕获原理示意图
实验流程
首先，将单细胞悬液加入BD Rhapsody™ cartridge（微孔板）中，通过随机分布和重力沉淀实现单细胞捕获；接下来，加入过量的磁珠加入到cartridge（微孔板）中，尽量使每个微孔中都有一个磁珠，以保证每个细胞都与一个磁珠配对；随后，随着细胞在微孔中裂解，mRNA分子被磁珠上的Oligo（寡核苷酸片段）捕获后，磁珠从微孔板中被收集到一个单独的试管中，用于随后的cDNA合成、文库构建。
两种产品模式实验流程如下：
测序策略
推荐DNBSEQTM平台测序，测序策略： PE75
信息分析流程
测序得到的原始数据称为Raw reads，之后会根据BD平台单细胞RNA-Seq独特的文库结构，对Reads的cell lable、 UMI 和插入片段部分进行拆分，之后插入片段部分将比对到参考基因组，然后统计比对到各个区域的比例，并进行表达量统计；基于表达量的结果，进行细胞时间轨迹预测，细胞聚类等分析，基于差异表达的结果，进行KEGG富集、GO富集、蛋白互作网络分析等。
表1 信息分析内容
信息分析条款 | 信息分析内容 |
标准+高级信息分析 （需要基于良好的参考序列， 且每个样本拆分出的细胞数目上下浮动在20%或以内的误差皆属于正常范围） | 基本分析 1.测序结果统计; 2.比对结果统计; 3.定量分析; 标准分析 4. 质控（细胞周期因素去除，双胞去除等）; 5. 细胞聚类分析; 6. 样本间差异基因鉴定; 7. 细胞类别鉴定; 8. 差异表达基因GO功能分析; 9. 差异表达基因Pathway功能分析; 10. 差异表达基因TF编码能力预测; 11.差异表达基因蛋白互作分析; 12.基因相关性网络分析; 13.Reactome富集; 14.RNA速率; 15.细胞通讯iTALK; 16.细胞通讯cellphoneDB; 高级分析 17.细胞轨迹分析; 18.GSEA 富集（选做，需2个样本以上）； 19.GSVA 富集； 20.CNV分析（选做，肿瘤样本-需2个样本以上） |
定制化信息分析 | 可结合客户的需求，协商确定定制化信息分析内容。 |
交付周期
从样品复苏后，镜检符合上机要求、预付款到位开始（不包括由于样品等问题停滞时间以及试剂订购周期），细胞类型及生物信息分析整体完成周期视不同的类型而有所变化。
DNBSEQ平台
样品数≤8个，45个工作日(含建库、测序、标准信息分析)。
样品数≥9个，请单独咨询周期。
案例一：BD Rhapsody单细胞助力癌症发生发展及转移分子机制
发表杂志：Nature Cell Biology
样本选择：27个不同类型的前列腺肿瘤样本
发表时间：2021年1月
样本选择：
13个前列腺癌患者样本（12例前列腺癌原发灶和1例前列腺癌淋巴结转移灶）和14个包含正常组织和CRPC（Castration-Resistant Prostate Cancers）
研究结果：
获得来自27个组织的111,914个单细胞数据。通过对单细胞数据分析，在上皮细胞中发现明显的肿瘤细胞异质性。
1. 上皮细胞中发现与预后相关的细胞亚群
所有上皮细胞进一步分为16个细胞亚群，其中Cluster 10 和cluster12 分别被鉴定为Basal/Intermediate 和CellCycle亚群。通过临床数据分析，发现Basal/Intermediate跟较好的预后相关。
图1 上皮细胞关键亚群分群与预后关系
2. 肿瘤浸润免疫细胞分析
通过对免疫细胞亚群的分析，发现在两个效应T细胞（cluster3,5）和1个调节T细胞（cluster6）亚群中高表达KLK3基因，而KLK3基因是前列腺癌的特征基因。基因共表达网络分析的结果提示，T细胞中KLK3基因高表达可能跟囊泡运输有关，进一步采用流式分选、RNA 荧光原位杂交、免疫组化等验证实验也提供了相关的实验证据。
图2 前列癌微转移发生相关结果
3. 内皮细胞中鉴定出跟前列腺癌发展相关的细胞亚群
重新将3115个内皮细胞分为六个亚群，其中部分亚群表现肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）的分子特征，被鉴定为激活的内皮细胞（aECs）。不同程度的前列腺癌单细胞数据拟时间分析结果表明，激活的内皮细胞亚群随肿瘤发展比例增加。并且，流式分选的结果也能证实激活的内皮细胞主要来自去势抵抗性前列腺癌样本（CRPC）。
图3 aECs细胞亚群与肿瘤发展显著性相关
案例二：BD Rhapsody单细胞RNA测序鉴定半月板祖细胞并揭示半月板退变过程
发表杂志：Annals of the Rheumatic Diseases
样本选择：健康人半月板、退化半月板和小鼠半月板损伤模型
发表时间：2019年12月
样品选择：
将半月板组织（3个健康人）从滑膜上剥离，切成小块。利用4mg/mL的蛋白酶和2mg/mL胶原酶P先后对这些小块进行消化处理。
研究结果：
1. 研究人员利用BD Rhapsody平台，以半月板细胞为样本进行了单细胞RNA测序，根据单细胞转录组数据的分析，从健康人半月板中分离出7个细胞亚群，其中包括2个新的细胞群：（1）内皮细胞(EC，表达CD93和CDH5)、（2）软骨干细胞(CPC，表达CDK1和BIRC5)、（3）调节性软骨细胞 (Reg C，表达BMP2和FOSL1)、（4）纤维软骨细胞 (FC，表达COL1A1、COL3A1和COL6A1)、（5）增生前软骨细胞 (PreHTC，表达MMP1和TNFAIP6)、（6）纤维软骨细胞干细胞(FCP，同时表达纤维软骨细胞基因 COL1A1和COL3A1以及间充质干细胞标记基因MCAM和MYLK)、（7）增殖纤维软骨细胞 (ProFC, 表达纤维软骨细胞基因COL1A1和生长因子FGF7和CTGF)。
图3 健康人体半月板单细胞图谱
2. 研究人员为了研究FCP向亚群的分化和相应的基因表达，选择FCP、 ProFC、FC、PreHTC和RegC构建了模拟的细胞轨迹，其中包含对应于两个不同细胞轨迹的末端；还评估了在FCP分化过程中细胞的基因表达。结果表明，表达模式与两种不同的轨迹相一致，也就是单细胞RNA测序分析与半月板的发育过程相关。
图4 细胞轨迹
3. 研究人员将健康人群半月板细胞和退化半月板细胞单细胞RNA测序结果在t-SNE进行对比分析。结合基因表达分析结果，发现DegP细胞群主要分布在退化半月板中，DegP是半月板退化的关键因素。
图5 健康人群半月板和退化半月板对比结果
案例三：BD Rhapsody单细胞研究疾病免疫相应机制
发表杂志：Cell
样本选择：109例COVID-19个体的242个血液样本
发表时间：2020年9月
样本选择：
53名患者和56名健康供体（其中包括8例流感样患者）的血液样本；
根据轻度和重度患者随病程发展的免疫细胞组成变化和响应情况，分成两个队列
研究结果：
在轻症患者中，具有干扰素刺激基因特征的HLA-DRhiCD11chi单核细胞比例升高。而在重症患者中，则表现出不同的分子特征：HLA-DR低表达，并有功能异常的成熟中性粒细胞证据。本文提供了对新冠感染系统免疫反应的全景式研究，并揭示了与新冠重症患者相关的髓样细胞组成变化。
1. 重症与轻症患者之间细胞分群存在差异
109例COVID-19个体的242个血液样本，通过蛋白质标记分析了总计2400万个细胞，通过scRNA-seq分析了> 328,000个细胞。单细胞数据分群的结果表明，轻症患者与重症患者之间存在差异：cluster1（CD14+ monocytes 高表达HLA-DRA, HLA-DRB1）和cluster2（CD14+HLA-DRhi monocyte ，高表达ISGs）主要存在于轻症患者，cluster3（低表达HLA-DRA，高表达 S100A8/9/12），cluster5， 6（LNDs）主要存在于重症患者。
图4 重症与轻症患者之间细胞分群存在差异
2. 单核细胞亚群分析
研究人员对单核细胞进行分群获得了7个单核细胞亚群，结果显示轻中症患者的单核细胞分布以 HLA-DRhi 型为主，而重症患者则以 HLA-DRlo 型为主（其中cluster0，2, 6低表达HLA-DR，跟新冠重症相关）。经过脂多糖（LPS）刺激后，与对照组相比从新冠肺炎患者分离的单核细胞对脂多糖刺激表现出钝性的细胞因子反应，特别是来自重度新冠肺炎患者的单核细胞。
图5 单核细胞亚群分析
1、细胞亚群分类
图1 细胞分类注释图
2、特异marker基因分析
图2 cluster特异marker基因小提琴图
3、样本间cluster差异表达基因分析
图3 样品间不同细胞类型差异基因点阵热图
根据选定的显著9个基因进行表达量热图展示
4、样本间相同cluster基因差异基因分析
图4 样品间相同细胞类型差异基因小提琴图
横坐标表示细胞类型，纵坐标表示表达百分比
5.CNV分析
图5 CNV分析
6. 细胞通讯
图6 左 互作网络图 右 互作circos图
7. RNA速率分析
图7 RNA速率分析
8. 轨迹分析与拟时间分析
图8 左 拟时间序列分析图，右 拟时间序列在所有细胞类型中的分析图
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样本要求 |
类型 |
组织：人、鼠、新鲜及梯度冻存组织 |
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细胞：PBMC、细胞系，组织解离细胞等 |
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细胞状态 |
细胞直径<=25μm，小于50um均可以尝试；细胞活性>70%；细胞浓度200-800个/μL，推荐送样>=细胞总量
105个。 |
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细胞悬液背景干净，无大量结团、碎片及杂质，不含Ca2+和Mg2+ |
Q1：BD平台捕获原理是什么？ 此种分选的优势是什么？
A1：细胞的自然沉降，可以减少细胞损伤，对低活率的细胞容忍度高。有数据支持，低活率细胞样本结果与捕获预期基本一致。提高项目的启动率。如果是50%低活率，做10X平台分选，死细胞成接团状态或者细胞碎片状态，就容易出现堵孔的情况，造成实验失败。
Q2：低活率细胞上BD分选实例？
A2：如下截图，活率58.66%，上样24000个细胞，其中活细胞14078个，分选后数据分析结果显示， 得到有效细胞为8343个。
Q3：细胞数量重要还是检测到的基因数重要？
A3：2019 年 发 表 在 Circulation 上 的 文 章“Single-Cell Analysis of the Normal Mouse Aorta Reveals Functionally Distinct Endothelial Cell Populations”在设计实验室 比较了不同测序深度对细胞聚类的影响，4 个主动脉样本中，2 条主动脉样本测序深度低 (17,000 reads/cell)，2 条主动脉样本测序深度高 (145,000 reads/cell)，分析得到的细胞数量二者之间无差异。且从不同测序深度来评估分群准确度的影响，当测序深度达到 2.5K reads/cell 时，细胞类型分类准确度达到 98% 并且相对一致。且增加单个细胞的测序深度，细胞类型分群准确度提升不明显。
综合测序数据量和细胞数，可知在低细胞数情况下，随着测序深度增加，细胞类型分类准确度依然维持在较低水平，但在低测序深度情况下，细胞类型分类准确度可以随细胞数量增加而增加，表明细胞数对细胞类型分类准确度的影响大于测序深度。
Q4：非人、鼠样本，可以用SMK试剂标记进行pooling分选操作吗？
A4： 不能，目前SMK试剂盒是有两种：人的全类型细胞SMK试剂盒和小鼠免疫细胞SMK试剂盒。
Q5：BD平台WTA文库插入片段大小及文库结构？
A5：如图所示，插入片段大小200-400bp；cell lable 是52bp； UMI是18bp。
Q6：测序策略推荐？
A6：测序策略是PE75，主要原因是BD软件识别75bp序列进行分析，同10x平台软件一样识别91bp分析一样。
Q7：WTA、TTA 以及SMK 全称？
A7： WTA：whole transcriptome analysis
TTA：Targeted Transcriptome analysis
SMK：Single-Cell Multiplexing Kit
Q8： 是否可以进行细胞核的分选？
A8： 从原理上可以尝试，测试效果未知；可以尝试。
Q9： 物种类型？
A9： 人、鼠、 哺乳类动物细胞可以尝试；植物样本暂时不接。
Q10：Scanner 可以进行四次质控的重要作用？
A10：可以实现实时监控，保质保量；如发现问题，可以及时调整和终止，节省成本。
