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小 RNA 测序
小RNA是一类重要的体内调节分子，主要包括miRNA、piRNA、siRNA、snRNA和snoRNA等。它的功能主要是诱导基因沉默，参与基因转录后调控，从而调节细胞生长、分化，以及个体发育、生殖等重要生物学过程。小RNA测序技术采用胶分离技术，收集样品中18-30nt的RNA片段，利用高通量测序技术，一次性获得单碱基分辨率的数百万条小RNA序列信息，依托强大的生物信息分析平台，鉴定已知小RNA，并预测新的小RNA及其靶标基因。
技术优势
研究内容
利用BGISEQ平台，对富集到的18-30nt的小RNA片段进行测序，对获得的有效数据进行序列长度分布统计，将筛选后的高质量序列分类注释，从而获得样品中包含的各组分及表达量信息，并对所有小RNA片段进行注释，对miRNA进行靶基因预测等分析。
一、标准分析
1、数据产出统计，对原始信息采集数据去接头污染，去低质量reads
2、18-30 nt Small RNA 信息采集结果的长度分布
3、Small RNA在选定的参考基因组上的分布(只能选定一个参考基因组)
4、Small RNA分类注释
①Small RNA与rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA的比对信息
②Small RNA与重复序列的比对信息
③Small RNA与exon/intron的比对信息
④Small RNA与miRBase中指定范围的已知的miRNA的比对
⑤miRNA家族分析
⑥动物保守piRNA注释分析(分析仅针对数据库中已有的物种：人、小鼠、斑马鱼、线虫、果蝇、大鼠、鸡、家蚕)
5、Small RNA预测(miRNA/siRNA/piRNA)
6、已知和新Small RNA 定量分析(miRNA/siRNA/piRNA)
7、已知和新Small RNA差异表达分析(miRNA/siRNA/piRNA)
8、已知和新miRNA表达/差异表达聚类分析
9、已知和新miRNA 靶基因预测
10、差异miRNA 靶基因GO 注释和KEGG 通路分析
二、高级分析
1、差异miRNA与差异靶基因的相关性分析；
2、差异miRNA与差异靶基因互作网络绘制；
3、互作靶基因功能富集分析（KEGG和GO）；
三、定制化信息分析
可结合客户的材料与需求，协商确定定制化信息分析内容。
文昌鱼免疫反应后的microRNA差异分析
Oncotarget, Aug. 28, 2017
本课题由南京大学生科院和华大基因合作完成，研究了脊椎动物研究范例文昌鱼在抵抗病毒的免疫过程中，microRNA的差异变化及其在免疫信号通路中所扮演的角色，数据在BGISEQ-500平台测序完成。
实验材料
本课题选用了54条个体相当的文昌鱼随机分为6组（9条每组），将pIC注射到处理组鱼的腹腔中，对照则选用了PBS注射。分别在注射后2、6、12个小时，将鱼整个身体存于液氮中以提取RNA并在BGISEQ-500进行小RNA高通量测序。每个实验都选用3个生物学重复。
分析流程
图1 研究思路
研究结果
表1 基本测序数据
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对照组 |
处理组 |
|||||
|
重复1 |
重复2 |
重复3 |
重复1 |
重复2 |
重复3 |
||
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Raw tags |
28,903,383 |
29,591,548 |
30,135,882 |
31,297,892 |
29,856,971 |
30,077,907 |
|
|
Clean tags (%) |
28,217,786 (97.63) |
28,742,324 (97.13) |
29,235,146 (97.01) |
29,965,063 (95.74) |
28,815,576 (96.51) |
29,191,246 (97.05) |
|
|
基因组比对率 (%) |
79.09 |
79.41 |
78.82 |
83.18 |
83.74 |
81.47 |
|
|
miRNA tag (%) |
8,801,127 (31.19) |
8,526,768 (29.67) |
8,325,221 (28.48) |
11,419,686 (38.11) |
11,310,345 (39.25) |
11,728,527 (40.18) |
|
|
Known miRNAs |
162 |
165 |
164 |
169 |
168 |
168 |
|
|
Novel miRNAs |
211 |
222 |
215 |
217 |
220 |
214 |
|
比对发现了miRNA的数量从对照的30%上升到了实验组的40%，并且分别分析了其中的已知miRNA及下游的差异表达结果。对发现的新miRNA也进行了分析，发现了mir51, mir2和mir108三种高表达差异的新miRNA。在随机挑选10个差异表达的miRNA进行定量qPCR后发现，泊松相关系数值达到了0.821，也即小RNA定量结果与实验结果具有相关性。
图2 二代测序与定量PCR的miRNA表达量对比
研究接着预测了差异表达的小RNA的目标调控基因，并将这些基因根据GO富集分类为生物学过程、细胞成分和分子生物学功能三个方面，其中在生物学过程中，有3个跟免疫反馈有关的条目富集的基因数量较多，对后续的生理学机理研究具有重要的指导意义。在另外两个方面，也找到了若干相关功能的基因数量。KEGG路径分析方面，一共发现了42个相关生物学路径，其中有14个路径跟免疫存在相关关系。
MicroRNA-144参与调控小鼠卵巢颗粒细胞
Cell death & disease, Feb. 2017
本研究由华中农大和湖北省农科院的研究者们在2017年2月共同完成并发表于《Cell Death and Disease》（IF = 5.965）。其研究对象是不同品种猪中的差异小RNA，利用模式动物小鼠成熟的分子验证体系研究目标microRNA的相关调控网络。通过microRNA-144的过表达和抑制实验，研究者发现了其在小鼠卵巢细胞中受CP2转录因子调控，并且能下调COX-2基因的表达水平和前列腺素E2（PGE2）的产量。
实验材料
多胎型CT母猪和LW母猪各3头，经过注射怀孕血清促性腺激素后，采集健康的卵巢卵泡细胞，提取细胞total RNA，建库进行small RNA高通量测序（华大平台）。
研究思路
图3 案例研究思路
部分结果展示
图4 部分miRNA的qRT-PCR验证
CH和LW为两种猪品种；counts为NGS表达量结果。
图5 本研究结果的示意图
A. miR-144参与的相关调控网络; B. miR-144影响小鼠粒层细胞凋亡进而导致卵泡畸形。
图1 小RNA分类注释
通过与已知的sRNA数据库比对，鉴定小RNA，各类小RNA所占比例。
X轴代表比较组，Y轴是对应的小RNA数。绿色代表下调，红色代表上调。
图中X轴表示差异倍数取log2的值，Y轴表示-log10(FDR)，绿色的点表示显著下调的sRNA，红色的点表示显著上调的sRNA。
X轴代表进行聚类分析的差异比对，Y轴代表差异基因。颜色代表差异倍数(颜色越红代表表上调倍数越大，越绿代表下调倍数越大)。
结合折叠的自由能推断可能的二级结构。
RichFactor指差异小RNA的靶基因中位于该pathway条目的基因数目与所有有注释基因中位于该pathway条目的基因总数的比值，RichFactor越大，表示富集的程度越大。Qvalue是做过多重假设检验校正之后的Pvalue，取值范围为0到1，越接近于零，表示富集越显著。图中只展示富集程度排名前20的pathway条目。
横坐标为差异小RNA的靶基因个数，纵坐标表示二级KEGG pathway通路。二级通路又分别属于不同的一级通路，图中用不同颜色表示一级通路类别。
表1 Small RNA组织样品送样建议
|
组织类型 |
具体要求 |
|
新鲜培养细胞（细胞数） |
≥2×105cell |
|
新鲜动物组织干重 |
≥30mg |
|
新鲜植物组织干重 |
≥100mg |
|
全血 |
≥ 1 mL全血收集的淋巴细胞 ≥ 1 mL Paxgene Blood RNA tube / RNAprotect®
Animal Blood Tubes收集的全血 |
|
菌体 (细胞数或干重) |
≥2×105cell or ≥30mg |
|
FFPE |
≥ 5片，未染色，100 mm2，5 ~ 10μm厚度 |
表2 Small RNA测序样品判定标准
|
样本类型 |
总量 |
浓度 |
RIN |
28S/18S |
基线和5S |
纯度 |
|
Total RNA (Plant / Fungi) |
≥1μg |
≥50ng/μL |
RIN≥7.5 |
28S/18S≥1.3 |
基线平整，5S峰正常 |
无DNA，蛋白/盐离子等污染，样本无色透明不粘稠 |
|
Total RNA (Animals) |
≥1μg |
≥50ng/μL |
RIN≥8.0 |
28S/18S≥1.5 |
||
|
Total RNA (Prokaryotes) |
≥1μg |
≥50ng/μL |
RIN≥8.0 |
23S/16S≥1.5 |
||
|
FFPE RNA |
≥1μg |
≥50ng/μL |
RIN≥2.0 |
DV200≥30% |
||
|
Total RNA (Insect) |
≥1μg |
≥50ng/μL |
N/A |
|||
|
Small RNA（<200nt） |
≥100ng |
≥5ng/μL |
N/A |
N/A |
||
|
Small RNA of Plasma/serum |
≥20ng |
≥2ng/μL |
N/A |
N/A |
||
Q1：小 RNA 测序对样品提取有什么特殊要求？
提取总RNA时建议不要使用Qiagen等公司的过柱试剂盒，也不要使用LiCl沉淀，以免丢失小片段RNA。如果直接提供small RNA样品，可以使用small RNA提取专用试剂盒来进行提取。
Q2：华大可以实现什么类型的样品建库测序？
动植物总RNA样品、微生物总RNA样品、200nt以内的小片段RNA样品、经切胶回收的small RNA样品、组织培养与细胞系样品、血清/血浆样品、组织液样品，FFPE样品、RIP样品,外泌体样本等，只要满足华大送样要求，均可在华大用于小RNA建库测序。
Q3：为什么实验结果中会存在降解的 rRNA序列？
由于 total RNA 常发生轻微的降解，而生物体内也有自然的降解过程，因此数据中就会含有小部分 mRNA 降解片段。但通常这个比例很低，并且取决于样品 total RNA 的质量。
Q4：进行小 RNA 测序时，客户除了样品以外还需要提供哪些相关信息？
需要提供相应物种的基因组和相关的 exon、intron、repeat 信息。如果没有本物种的基因组，需要提供近缘物种的相关信息。
Q5：在华大做小RNA测序, 推荐测序平台是?
推荐BGISEQ-500平台, 该平台测序已有文章发表: cPAS-based sequencing on the BGISEQ-500 to explore small non-coding RNAs. Clinical Epigenetics. 2016 8:123.