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小 RNA 测序

       小RNA是一类重要的体内调节分子,主要包括miRNA、piRNA、siRNA、snRNA和snoRNA等。它的功能主要是诱导基因沉默,参与基因转录后调控,从而调节细胞生长、分化,以及个体发育、生殖等重要生物学过程。小RNA测序技术采用胶分离技术,收集样品中18-30nt的RNA片段,利用高通量测序技术,一次性获得单碱基分辨率的数百万条小RNA序列信息,依托强大的生物信息分析平台,鉴定已知小RNA,并预测新的小RNA及其靶标基因。

技术优势

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研究内容

       利用BGISEQ平台,对富集到的18-30nt的小RNA片段进行测序,对获得的有效数据进行序列长度分布统计,将筛选后的高质量序列分类注释,从而获得样品中包含的各组分及表达量信息,并对所有小RNA片段进行注释,对miRNA进行靶基因预测等分析。

一、标准分析

1、数据产出统计,对原始信息采集数据去接头污染,去低质量reads         

2、18-30 nt Small RNA 信息采集结果的长度分布         

3、Small RNA在选定的参考基因组上的分布(只能选定一个参考基因组)

4、Small RNA分类注释

①Small RNA与rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA的比对信息   

②Small RNA与重复序列的比对信息

③Small RNA与exon/intron的比对信息    

④Small RNA与miRBase中指定范围的已知的miRNA的比对

⑤miRNA家族分析

⑥动物保守piRNA注释分析(分析仅针对数据库中已有的物种:人、小鼠、斑马鱼、线虫、果蝇、大鼠、鸡、家蚕)

5、Small RNA预测(miRNA/siRNA/piRNA)

6、已知和新Small RNA 定量分析(miRNA/siRNA/piRNA)

7、已知和新Small RNA差异表达分析(miRNA/siRNA/piRNA)

8、已知和新miRNA表达/差异表达聚类分析

9、已知和新miRNA 靶基因预测

10、差异miRNA 靶基因GO 注释和KEGG 通路分析

二、高级分析

1、差异miRNA与差异靶基因的相关性分析;

2、差异miRNA与差异靶基因互作网络绘制;

3、互作靶基因功能富集分析(KEGG和GO);

三、定制化信息分析

可结合客户的材料与需求,协商确定定制化信息分析内容。




文昌鱼免疫反应后的microRNA差异分析

                                                                                                                                 Oncotarget, Aug. 28, 2017

       本课题由南京大学生科院和华大基因合作完成,研究了脊椎动物研究范例文昌鱼在抵抗病毒的免疫过程中,microRNA的差异变化及其在免疫信号通路中所扮演的角色,数据在BGISEQ-500平台测序完成。

实验材料

       本课题选用了54条个体相当的文昌鱼随机分为6组(9条每组),将pIC注射到处理组鱼的腹腔中,对照则选用了PBS注射。分别在注射后2、6、12个小时,将鱼整个身体存于液氮中以提取RNA并在BGISEQ-500进行小RNA高通量测序。每个实验都选用3个生物学重复。

分析流程

图2

图1 研究思路

研究结果

表1 基本测序数据

 

对照组

处理组

重复1

重复2

重复3

重复1

重复2

重复3

Raw tags

28,903,383

29,591,548

30,135,882

31,297,892

29,856,971

30,077,907

Clean tags (%)

28,217,786 (97.63)

28,742,324 (97.13)

29,235,146 (97.01)

29,965,063 (95.74)

28,815,576 (96.51)

29,191,246 (97.05)

基因组比对率 (%)

79.09

79.41

78.82

83.18

83.74

81.47

miRNA tag (%)

8,801,127 (31.19)

8,526,768 (29.67)

8,325,221 (28.48)

11,419,686 (38.11)

11,310,345 (39.25)

11,728,527 (40.18)

Known miRNAs

162

165

164

169

168

168

Novel miRNAs

211

222

215

217

220

214

        比对发现了miRNA的数量从对照的30%上升到了实验组的40%,并且分别分析了其中的已知miRNA及下游的差异表达结果。对发现的新miRNA也进行了分析,发现了mir51, mir2和mir108三种高表达差异的新miRNA。在随机挑选10个差异表达的miRNA进行定量qPCR后发现,泊松相关系数值达到了0.821,也即小RNA定量结果与实验结果具有相关性。

图3

图2 二代测序与定量PCR的miRNA表达量对比

       研究接着预测了差异表达的小RNA的目标调控基因,并将这些基因根据GO富集分类为生物学过程、细胞成分和分子生物学功能三个方面,其中在生物学过程中,有3个跟免疫反馈有关的条目富集的基因数量较多,对后续的生理学机理研究具有重要的指导意义。在另外两个方面,也找到了若干相关功能的基因数量。KEGG路径分析方面,一共发现了42个相关生物学路径,其中有14个路径跟免疫存在相关关系。

 

MicroRNA-144参与调控小鼠卵巢颗粒细胞

                                                                                                     Cell death & disease, Feb. 2017

       本研究由华中农大和湖北省农科院的研究者们在2017年2月共同完成并发表于《Cell Death and Disease》(IF = 5.965)。其研究对象是不同品种猪中的差异小RNA,利用模式动物小鼠成熟的分子验证体系研究目标microRNA的相关调控网络。通过microRNA-144的过表达和抑制实验,研究者发现了其在小鼠卵巢细胞中受CP2转录因子调控,并且能下调COX-2基因的表达水平和前列腺素E2(PGE2)的产量。

实验材料

       多胎型CT母猪和LW母猪各3头,经过注射怀孕血清促性腺激素后,采集健康的卵巢卵泡细胞,提取细胞total RNA,建库进行small RNA高通量测序(华大平台)。

研究思路

图4

图3 案例研究思路

部分结果展示

图5

图4 部分miRNA的qRT-PCR验证

CH和LW为两种猪品种;counts为NGS表达量结果。

 

图6

图5 本研究结果的示意图

A. miR-144参与的相关调控网络; B. miR-144影响小鼠粒层细胞凋亡进而导致卵泡畸形。

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图1  小RNA分类注释

通过与已知的sRNA数据库比对,鉴定小RNA,各类小RNA所占比例。

1

图2  差异表达miRNA   

X轴代表比较组,Y轴是对应的小RNA数。绿色代表下调,红色代表上调。

2

图3  差异miRNA火山图

图中X轴表示差异倍数取log2的值,Y轴表示-log10(FDR),绿色的点表示显著下调的sRNA,红色的点表示显著上调的sRNA。

3

图4  差异表达小RNA层次聚类

X轴代表进行聚类分析的差异比对,Y轴代表差异基因。颜色代表差异倍数(颜色越红代表表上调倍数越大,越绿代表下调倍数越大)。

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图5  预测miRNA前体的茎环结构

结合折叠的自由能推断可能的二级结构。

8

图6  pathway富集统计散点图

RichFactor指差异小RNA的靶基因中位于该pathway条目的基因数目与所有有注释基因中位于该pathway条目的基因总数的比值,RichFactor越大,表示富集的程度越大。Qvalue是做过多重假设检验校正之后的Pvalue,取值范围为0到1,越接近于零,表示富集越显著。图中只展示富集程度排名前20的pathway条目。

9

图7  KEGG通路注释分类统计图

横坐标为差异小RNA的靶基因个数,纵坐标表示二级KEGG pathway通路。二级通路又分别属于不同的一级通路,图中用不同颜色表示一级通路类别。


表1  Small RNA组织样品送样建议

组织类型

具体要求

新鲜培养细胞(细胞数)

2×105cell

新鲜动物组织干重

30mg

新鲜植物组织干重

100mg

全血

1 mL全血收集的淋巴细胞

≥ 1 mL Paxgene Blood RNA tube / RNAprotect® Animal Blood Tubes收集的全血

菌体 (细胞数或干重)

2×105cell or ≥30mg

FFPE

5片,未染色,100 mm25 ~ 10μm厚度

表2  Small RNA测序样品判定标准

样本类型

总量

浓度

RIN

28S/18S

基线和5S

纯度

Total RNA (Plant / Fungi)

1μg

≥50ng/μL

RIN≥7.5

28S/18S≥1.3

基线平整,5S峰正常

DNA,蛋白/盐离子等污染,样本无色透明不粘稠

Total RNA (Animals)

1μg

50ng/μL

RIN≥8.0

28S/18S≥1.5

Total RNA (Prokaryotes)

1μg

50ng/μL

RIN≥8.0

23S/16S≥1.5

FFPE RNA

1μg

50ng/μL

RIN≥2.0

DV200≥30%

Total RNA (Insect)

1μg

50ng/μL

N/A

Small RNA<200nt

100ng

5ng/μL

N/A

N/A

Small RNA of Plasma/serum

20ng

2ng/μL

N/A

N/A


Q1:小 RNA 测序对样品提取有什么特殊要求? 

提取总RNA时建议不要使用Qiagen等公司的过柱试剂盒,也不要使用LiCl沉淀,以免丢失小片段RNA。如果直接提供small RNA样品,可以使用small RNA提取专用试剂盒来进行提取。

Q2:华大可以实现什么类型的样品建库测序?

动植物总RNA样品、微生物总RNA样品、200nt以内的小片段RNA样品、经切胶回收的small RNA样品、组织培养与细胞系样品、血清/血浆样品、组织液样品,FFPE样品、RIP样品,外泌体样本等,只要满足华大送样要求,均可在华大用于小RNA建库测序。

Q3:为什么实验结果中会存在降解的 rRNA序列? 

由于 total RNA 常发生轻微的降解,而生物体内也有自然的降解过程,因此数据中就会含有小部分 mRNA 降解片段。但通常这个比例很低,并且取决于样品 total RNA 的质量。

Q4:进行小 RNA 测序时,客户除了样品以外还需要提供哪些相关信息? 

需要提供相应物种的基因组和相关的 exon、intron、repeat 信息。如果没有本物种的基因组,需要提供近缘物种的相关信息。 

Q5:在华大做小RNA测序, 推荐测序平台是?

推荐BGISEQ-500平台, 该平台测序已有文章发表: cPAS-based sequencing on the BGISEQ-500 to explore small non-coding RNAs. Clinical Epigenetics. 2016 8:123.


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