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糖基化作为一种重要的翻译后修饰，广泛存在于细胞膜表面与体液中，哺乳动物体内约50%的蛋白都被糖基化修饰。N糖基化被认为参与到细胞间信号识别、转导、调控、蛋白质折叠、定位、空间构象稳定以及免疫调控等生物学功能中，并参与到肿瘤等疾病的发生与发展。近年来，越来越多的研究表明基于位点特异性水平的蛋白质N-连接糖基化的精确表征对于许多疾病的新诊断标志物和潜在治疗靶点的发现，以及针对各种病毒的有效疫苗的开发都具有很大价值。
 

N糖基化修饰主要发生于 N-X-S/T（天冬酰胺-X-丝氨酸/苏氨酸，XX可以是除脯氨酸以外的任意氨基酸）的特定氨基酸基序上，N糖链主要由与天冬酰胺上相连的五糖核心和还原末端的分支天线组成，五糖核心是由两个N-乙酰葡糖胺与三个甘露糖组成的N糖链共有结构，五糖核心也会进一步被一些单糖修饰：被核心岩藻糖修饰的五糖核心，平分型五糖核心，被核心岩藻糖修饰的平分型五糖核心。根据五糖核心外围生长的天线类型，糖链又可被分为三种糖型，高甘露糖型——糖链两侧的分支仅由甘露糖组成，复杂型——糖链两侧的分支由N-乙酰葡糖胺、半乳糖、唾液酸与岩藻糖等组成，混合型——糖链两侧的分支一侧为高甘露糖分支一侧为复杂分支。

传统的N-连接糖蛋白质组定量分析去除了糖链，只对去糖基化多肽进行分析，缺失了复杂的糖链中蕴藏的遗传信息。基于完整糖肽的方法对N-连接糖蛋白质进行研究，可以同时获得糖链结构、糖基化修饰肽段及糖链和糖基化位点的对应关系等信息，为蛋白糖基化研究提供更全面的解决方案。通过标记定量技术可以在一次实验中对多达16个糖蛋白样品进行定量比较，该定量方法几乎可以对任何蛋白样品进行定量分析，具有高定量精度的特点，目前已经越来越广泛地应用于定量蛋白质组学领域。

1. N-连接完整糖肽鉴定

N-连接完整糖肽鉴定分析从蛋白质的提取开始，经过酶解、混合阴离子交换固相萃取柱（Max柱）富集，之后经过高效液相分离，在质谱上机分析时采用HCD 20.00-33.00的阶梯能量碎裂模式。StrucGP首先在包含氧鎓离子的高能量谱图中对N-连接完整糖肽中的多肽链序列进行鉴定，随后在低能量谱图中通过模块化鉴定策略对N-连接完整糖肽的核心结构、糖型与分支结构进行解析，进而完成对N-连接完整糖肽的鉴定。

图1  N-连接完整糖肽鉴定技术流程

2. N-连接完整糖肽IBT/TMT定量

IBT或TMT定量方法可以在一次串联质谱实验中同时比较多至16个样品中的蛋白的相对含量，分别为蛋白提取、酶解、标记、混合糖肽富集、高效液相分离和液相串联质谱分析。在一级质谱时，平衡基团可以确保无论用哪种报告离子标记肽段，都显示为相同的质荷比值。在二级质谱时，平衡基团发生中性丢失，报告离子的强度可以反映肽段的相对丰度值，其余峰为肽段碎裂后的子离子峰，用于后续鉴定。

图2  N-连接完整糖肽定量技术流程

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