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外泌体样本定制化处理

外泌体是一种由细胞主动分泌的小囊泡,大小均一,脂质双层膜结构,直径30-100nm,天然存在于体液中(血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等),几乎所有培养的细胞均可分泌外泌体。研究发现,外泌体内包含复杂的核酸和蛋白质,其中许多RNA分子已被证实参与到肿瘤的发生过程,因此对外泌体RNA的研究逐年递增。

自2007年首次在外泌体中发现mRNA和miRNA,研究者已在人类及小鼠外泌体中发现了数千个不同 mRNA,而且有些转录本只存在于外泌体中,在胞内却无法检测到,这表明RNA进入外泌体的过程会受到某些特殊的分选机制控制。此外,蛋白质的差异表达是区分不同来源外泌体的重要特点,已成为研究外泌体起源的重要途径。针对外泌体进行蛋白质组学研究,可以揭示疾病发病机制、寻找疾病诊断和预后的生物标志物、筛选疾病治疗靶点等,这些使得外泌体中蛋白质也成为近几年的一个研究热点。

 

外泌体样本定制化实验内容

1. 外泌体分离:超速离心分离法、PEG沉淀法、TIO2富集法(质谱方向新方法)等

2. 外泌体鉴定:外泌体电镜鉴定、外泌体粒径检测、外泌体Western Blot检测

3. 外泌体下游研究对象:Small RNA、LncRNA、蛋白质

4. 外泌体下游研究方向:RNA研究、蛋白质谱研究

 

产品优势

1. 年3000例样本处理经验

2. 专业外泌体技术咨询、实验、优化团队

3. 个性化一对一实验方案设计

4. 完善的外泌体实验体系

 

多组学技术流程

1


华大科技外泌体业务已经处理包括细胞上清、血清、血浆、脑脊液、唾液、乳汁、腹液、羊水等众多类型的外泌体样本。



1、透射电镜鉴定结果展示

2

大小直径在80nm左右,较明显双层膜立体结构,与外泌体经典结构非常相似,可对分离的外泌体做初步的形态结构判断。

 

2、Nanosight粒径检测结果展示

3

4

粒子平均直径约104.3nm,主峰直径约73nm,符合外泌体大小定义区间,以上可在宏观上对外泌体进行数量及浓度的判断。

 

3、Western Blot蛋白标志物鉴定结果展示

6

CD63\CD81\TSG100目标条带清晰明显,Calnexin阴性指标干净未显影,以上可对外泌体样本进行定性判断。

 


1、外泌体分离+RNA提取

类型

送样量

血浆

≥2ml

血清

≥2ml

细胞培养上清液

≥15ml

2、外泌体分离+鉴定+RNA提取

类型

送样量

管数

血浆

≥4ml

1.2ml/管,至少4管

血清

≥4ml

1.2ml/管,至少4管

细胞培养上清液

≥50ml

15ml/管,至少3管

3、外泌体质谱送样量

       A、仅质谱检测(实验过程中,无需将外泌体单独分离出来)

类型

送样量

血浆

≥100μl

血清

≥100μl

细胞培养上清液

≥15ml

       B、外泌体分离+鉴定

类型

送样量

血浆

≥2ml

血清

≥2ml

细胞培养上清液

≥15ml

 

4、血浆组织收集方法建议(用于外泌体分离)

区别于常规血浆分离,用于分离外泌体的血浆需要离心2次,详细步骤如下:

1)    选取EDTA抗凝采血管或柠檬酸盐抗凝采血管(不可用肝素管),建议采取10mL全血,采血后上下颠倒混匀8-10次;

2)    可将采血管暂放于4℃冰箱或置于冰盒中,1小时之内进行下一步的离心处理;

3)    从冰箱中取出采血管,与其他离心管配平,采用水平转子离心机,4℃下1900 x g(3000 rpm)离心10min。此步离心结束后保持离心管4℃制冷状态;

4)    移液枪小心吸取上层血浆(黄色层)到新的尖底离心管中(避免吸到中间层,中间层包含白细胞和血小板)。通常10 mL全血大约能得到4-5 mL血浆;

5)    将上步得到的血浆进一步离心,4℃下3000 x g离心15 min(或者16,000g离心10 min)或者是过0.8um的无菌滤膜;

注:此步骤去除粘附在细胞残片上的细胞核酸;

6)    小心吸取上清到1.5mL或2mL离心管中,每管分装1 .2mL血浆。送样前可冻存于-20℃或者-80℃。(至少送4管(1.2ml)血浆);

7)干冰寄送。


5、血清组织收集方法建议(用于外泌体分离)

1)    准备好采血管(无抗凝剂,如EDTA或者是柠檬酸盐),建议采取10mL全血;

2)    将采血管放于室温下(15-25℃)至少30min,使血液完全凝集;

3)    采用水平转子离心机,4℃下1900xg (3000 rpm)离心10min。此步离心结束后保持离心管4℃制冷状态;

4)    移液枪小心吸取上层血清(黄色层)到新的尖底离心管中,避免打扰到细胞层。通常10 mL全血大约能得到3-5 mL血清;

5)    将上步得到的血清进一步离心,4℃下3000 x g离心15 min(或者16,000 rpm离心10 min);

6)    小心吸取上清到新的离心管中,避免吸到沉淀,此时沉淀沿离心管外侧形成弥散的沉淀;

7)    将所有上清,务必先混匀后再分装,每管分装1.1-1.2 mL血清,立即冻存于-20℃或者-80℃,建议送4管。


6、细胞培养液组织收集方法建议(用于外泌体分离)

1)    在细胞融合度达到95%左右时,将细胞用PBS洗三遍后加入10ml无血清培基,48h后收集细胞培基;(此步处理仅供参考,不同的细胞处理方式稍有差异)

2)    收集到的细胞培基,4 °C 下800 × g 离心10 min,去除细胞;

3)    吸取上清于新的离心管中,4 °C 下12,000 × g 离心 30 min;

4)    将上清液过0.22um无菌针头滤膜;

5)    将同一次实验的滤液混匀,后分装于15ml离心管中,每管分装15ml;

6)    立即冻存于-20℃或者-80℃。干冰寄送,建议寄送至少3管分装好的细胞培养液(不同类型的细胞培养液外泌体提取得率不一);

 

参考文献:

[1] Lv LH1, Wan YL, Lin Y, et, al. Anticancer drugs cause release of exosomes with heat shock proteins from human hepatocellular carcinoma cells that elicit effective natural killer cell antitumor responses in vitro.J Biol Chem. 2012 May 4;287(19):15874-85. 


Q1:可实现什么类型体液标准化分离?是否承接其它类型体液?

目前可实现血浆,血清,细胞培养上清液三种类型的体液外泌体分离与鉴定、测序分析、质谱分析,其它类型体液需要定制化评估。

 

Q2:外泌体鉴定服务包含哪些?

根据国际细胞外囊泡学会于2014年发布的指导性声明文件,目前研究和定义细胞外囊泡的最低实验要求是证明样品中存在细胞外囊泡,对于分离提取的外泌体,需要通过以下手段进行确认:a、透射电镜形态学鉴定;b、Nanosight粒径分布分析;c、Westen Blot蛋白标志物鉴定。其中Westen Blot蛋白标志物鉴定至少需有3个阳性蛋白标志物,1个阴性蛋白标志物,常用指标如下表,如需其它指标请自备抗体。

常用指标

CD9、CD63、CD81、TSG101、Calnexin、Flotillin、EpCAM、HPS70、ADAM10、Ache

推荐指标

阳性指标CD63、CD81、TSG101,阴性指标Calnexin

其他指标

提前沟通确认,如抗体库无,需自行准备

 

Q3:这三种类型外泌体分离+鉴定+RNA提取标准周期?

1. 样本数≤8个,外泌体分离+RNA提取标准周期,10个自然日;

2. 样本数≤8个,外泌体分离+鉴定+RNA提取标准周期,21个自然日;

3. 样本数>8个,周期需要额外增加;

4. 质谱产品线同上(无需RNA提取)。

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