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环状 RNA 测序

         环状RNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子,与传统的线性RNA(linear RNA)不同,circRNA分子合呈封闭环状结构,且不受RNA外切酶影响,表达更稳定,不易降解。近期华大推出环状RNA高通量测序服务,可进行环状RNA的鉴定以及环状RNA与miRNA‘’海绵效应‘’分析, 可实现ceRNA(competing endogenous RNAs,内源竞争RNA)机制等研究。可应用在物种环状RNA表达谱构建,环状RNA疾病生物标记开发,环状RNA作用机制研究等方面。

技术优势

图7

信息分析内容

一、标准信息分析

      1. 基本数据统计

        1.1去除接头序列、低质量序列得到clean data

        1.2与核糖体数据库比对,去除核糖体RNA数据

      2. 环状RNA预测鉴定

      3. 环状RNA所在线性基因注释

      4. 环状RNA在基因组上的定位

      5. 环状RNA表达定量分析

      6. 样品(组)间表达差异分析

二、高级信息分析

      1. 差异环状RNA来源的基因GO功能及富集分析

      2. 差异环状RNA来源的基因Pathway功能及富集分析

      3. 环状RNA与miRNA互作分析(适用于人/小鼠物种)




CircRNA表达谱构建——通过高通量测序方法鉴定大豆环状RNA表达

Genome-wide identification and characterization of circular RNAs by high throughput sequencing in soybean. Scientific Reports. 2017;7:5636. 

合作单位:中科院油料所,BGI 

案例描述

        大豆是古老的四倍体物种,大部分基因是多个拷贝的同源基因。尽管其他物种的环状RNA已经鉴定,但是在大豆中的环状RNA表达情况未知,尤其是同源基因来源的环状RNA表达情况,所以本次研究采用高通量测序手段,结合RNase R酶处理方法和生信分析的手段揭示大豆环状RNA表达。本次研究共鉴定到5372种环状RNA,大约80%的同源环状RNA来自同源基因,但仍呈现不同的表达模式,2134个环状RNA被预测为92个miRNA靶向物,环状RNA和环状RNA的转录本表达模式呈现组织特异性,基于环状RNA转录来源的基因功能主要集中在发育、代谢,以及组织特异性。

部分研究结果展示

1.     对大豆根、茎、叶的cricRNA及类型鉴定发现,总计鉴定5372个环状RNA。

表1  大豆根、茎。叶circRNA鉴定及类型统计表

1

2.     大豆鉴定的环状RNA来源的基因,经分析发现:80%的基因转录形成1种环状RNA转录本(图2a);另外大豆多拷贝的同源基因可形成不同的环状RNA,即为同源环状RNA。例如:三个同源基因(Glyma05g30210, Glyma08g13370,Glyma08g20100和 Glyma12g29120)转录生成同源环状RNA,来源不同外显子区域,所以命名不同 (图 2b).

2

图2a  环状RNA转录来源的基因和同源环状RNA统计:(a)环状RNA来源的基因转录形成不同转录本类型统计;(b)举例说明同源环状RNA3. 预测到2,134 (39.7%)个 circRNAs 预测到92个miRNA结合位点, 共计5648个相互关系(见图3a)。其中绘制57个差异显著表达环状RNA及其靶向miRNA互作网路关系(见图3b).

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图3  大豆环状RNA与miRNA互作关系网络研究

 

CircRNA biomarker鉴定——来自ANXA2基因转录的环状RNA可作为神经性多发性硬化症诊断的biomarker

Circular RNA profiling reveals that circular RNAs from ANXA2 can be used as new biomarkers for multiple sclerosis[J]. Human Molecular Genetics, 2017

发表单位:西班牙Biodonostia健康研究中心等

研究摘要

        为寻找多发性硬化症(MS)患病诊断的biomarker,本次采用患病组和对照组各选4个血液白细胞样本进行研究,在406个差异表达环状RNA中找到2个目标环状RNA:circ_0005402和circ_0035560,在20个患病RR-MS个体中和18个正常人中进行验证,使用The Wilcoxon test证实这两个环状RNA在患病中显著低表达。并通过ROC 生存曲线分析:circ_0005402、circ_0035560 敏感性和特异性较高,可作为潜在的临床患病诊断的biomarker。

部分研究结果展示

1、共发现406个差异表达环状RNA,其中324低表达,82高表达;通过qPCR验证10个差异表达环状RNA, 其中5个高表达,5个低表达,其中验证率为90%。

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图1  多发性硬化症环状RNA差异分析,a:差异环状RNA火山图分析;b:差异环状RNA聚类图分析;c:qPCR验证结果

2、通过ROC生存分析,结果显示来自ANXA1-mRNA, circ_0003452_2 和circ_0005402具有较高敏感度,可作为潜在诊断的biomarker。

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图2  ANXA1-mRNA, circ_0003452_2 and circ_0005402 ROC生存曲线分析


图1  circRNA数目在基因组上的分布图

外圈表示染色体,内圈表示以1,000,000个碱基为滑动窗口时,circRNA数目在染色体上的变化。

图2  circRNA表达量箱线图

X轴为样品名称,Y轴为log10(RPB),每个区域的箱线图对应五个统计量(自上而下分别为最大值、上四分位数、中值、下四分位数和最小值)。

图3  差异circRNA的Volcano-plot分布图

X轴代表log2转换后的差异倍数值,Y轴代表-log10转换后的显著性值。红色代表上调的circRNA,蓝色代表下调的circRNA,灰色代表非差异的circRNA。

图4  差异circRNA的Scatter-plot分布图

X、Y轴均代表circRNA表达量的对数值。红色代表上调的circRNA,蓝色代表下调的circRNA,灰色代表非差异的circRNA。

图5  差异circRNA的表达量热图

X轴代表聚类分析的样品,Y轴代表差异circRNA。颜色代表log10转换后的表达量(颜色越深表示表达量越高,越浅表示表达量越低)。

图6  差异circRNA来源基因的GO功能分类图

X轴代表差异表达circRNA来源基因的数目,Y轴代表GO功能分类。

图7  差异circRNA来源基因的Pathway分类图

X轴代表基因所占的比例,Y轴代表KEGG功能分类。将基因根据参与的KEGG代谢通路分为7个分支:细胞过程(Cellular Processes)、环境信息处理(Environmental Information Processing)、遗传信息处理(Genetic Information Processing)、人类疾病(Human Diseasea)(仅限动物)、代谢(Metabolism)、有机系统(Organismal Systems)、药物开发(Drug Development)。

图8  差异circRNA来源基因的Pathway富集结果图

X轴代表富集因子值,Y轴代表通路名称。颜色代表q-value(颜色越白值越大,越蓝值越小),值越小代表富集结果越显著。点的大小代表差异circRNA来源基因的数目(点越大代表数目越大,越小代表数目越少)。Rich Factor指的是富集因子值,是注释上某一通路的前景值(差异circRNA来源基因的个数)与注释上某一通路的背景值(所有circRNA来源基因的个数)之商,数据越大,说明富集结果越明显。


表1  CircRNA组织样品送样建议

组织类型

具体要求

新鲜培养细胞(细胞数)

≥1×106 cell

新鲜动物组织干重

≥50 mg

新鲜植物组织干重

≥200 mg

全血(哺乳动物)

≥2.5 mL淋巴细胞

≥2.5 mL Paxgene Blood RNA tube / RNAprotect® Animal Blood Tubes收集的全血

表2  CircRNA测序样品判定标准

样本类型

总量

浓度

RIN

28S/18S

基线和 5S

纯度

Total RNA
(Plant)

≥5 μg

≥40 ng/μL

RIN≥6.5

28S/18S≥1.0

基线平整,5S 峰正常

DNA,蛋白/盐离子等污染,样本无色透明不粘稠

Total RNA
(
Animal
)

≥5 μg

≥40 ng/μL

RIN≥7.0

28S/18S≥1.0


Q1:Total RNA最低送样量是多少?

5 ug/单次,详细可见上面的送样建议。

Q2:环状RNA 推荐数据量?

根据饱和度分析,一般推荐10 G以上数据。

Q3:circRNA需要做生物学重复吗?

需要。至少3个,实际越多越好。

Q4:lncRNA数据分析和环状RNA标准建库流程(R酶富集方法)分析的结果有什么区别?

LncRNA数据(10 G clean data)鉴定到1千到2千个环状RNA,数量级在千位;而富集方法       可鉴定到2W-3W个环状RNA,数据量级在万位;两种方式可根据客户研究目的和需求进行针对性推荐,如客户初期研究,可进行lncRNA建库测序方法,具有较高性价比;如果是针对性的研究环状RNA,可推荐环状RNA标准建库方法。

Q5:环状RNA验证方法?

定量验证:根据junction位点设计引物进行qPCR验证;

功能验证:使用circRIP方法验证miRNA Sponge功能;使用miRNA敲除及拮抗等模拟物进行功能验证。

Q6:环状RNA(circRNA)是不是很稳定、不存在降解?

CircRNA即为成环的RNA分子,其特性即是不易被RNase R降解。但是,实际上,降解分两种,一种是RNase R的降解,一种是水解。水解是不区分环状或者非环状的过程,并且事实上环状更容易被水解,因为环状的碱基基团靠的近,羟基更容易去攻击磷酸羟基键。将circRNA放在室温或者60℃或者在镁离子作用下,它们依然较容易被水解。在使用RNase R降解的过程中,体系中含有镁离子(Mg2+),因此实际的操作过程可能存在对circRNA的水解。所以,RNase R降解法获得circRNA的这种操作,可以提高检测的敏感性,但是不能提高特异性。

Q7:如何预测circRNA?

因为在circRNA纯化收集的过程中,需要去除核糖体RNA和线性RNA,然后打断成片段进行建库测序。在得到测序结果后,我们需要对circRNA进行预测鉴定。由于circRNA头尾相接易环化,如果测序结果能获得接头序列(Jumping Sequence),便认为是circRNA。

Q8:CircRNA适宜用芯片技术还是测序技术?

建议使用测序技术,有利于新结果的发现和鉴定。

Q9:样本间鉴定circRNA的差异大吗?

大。样本均一化操作在circRNA中是错误的,因为circRNA不属于上面所提到的“绝大部分基因”(这部分基因在均一化时我们认为几乎没有变化),因此它的含量存在较大变化。


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