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蛋白 DIA 定量分析

       蛋白定量DIA产品,主要采用数据非依赖性采集模式(data independent acquisition,DIA),通过液质联用技术(LC-MS/MS)对蛋白质酶解肽段进行质谱分析,结合传统的数据依赖性采集模式(data dependent acquisition,DDA)构建的谱图库,利用业内顶尖的商业化DIA分析软件Spectronaut,可对蛋白质组进行鉴定、定量,获得肽段、蛋白及所属物种来源、蛋白表达量变化等信息。

 产品优势

蛋白定量DIA技术,采用全景式数据采集模式,效果对比下:

DIA vs DDA

图1 HRM(DIA)vs Shotgun proteomics(DDA)

图中横坐标是分组的样本编号,纵坐标是蛋白质种类,该图展示的是各样本中,不同质谱采集模式下,蛋白质峰强度情况。其中DIA比DDA的峰强度覆盖度更好,偏向性较小;DDA缺失值较多,并且对高丰度肽段有偏向性。

  • 鉴定数高:鉴定数提高30%;一针组织样本鉴定数可达7000+
  • 重复性好:技术重复性提高30%,可达90%
  • 定量准确性好:通过二级谱峰面积定量,大项目质控CV低至25%
  • 质控完善:加入iRT校正;QC样本重复性CV<30%的比例大于67%
  • 周期短:实际样本上机不分组,提高结果重复性的同时,压缩周期3倍以上
  • 费用低:降低费用3倍以上

 

产品应用

图片 2


技术路线

DIA技术路线


 信息分析内容

信息分析条款

信息分析内容

标准信息分析

谱图库构建

1.1 数据产出统计

1.2 谱图库鉴定结果

标准信息分析内容

2.1 数据产出统计

2.2 数据质控(组内变异系数、主成分分析以及样本定量相关性)

2.3 蛋白质鉴定和定量结果

2.4 蛋白质GO分析

2.5 蛋白质COG/KOG分析

2.6 蛋白质Pathway代谢通路分析

2.7 差异蛋白的GO富集分析

2.8 差异蛋白COG/KOG富集分析

2.9 差异蛋白的Pathway富集分析

2.10 重复性分析(仅针对设计了重复的实验)

2.11多样品间表达模式聚类(三个或三个以上样品可提供)

2.12 时间序列分析

2.13 差异表达蛋白互作分析

2.14 差异表达蛋白亚细胞定位

定制化信息分析

蛋白质组与转录组/RNA-seq表达量关联分析

3.1 表达量关联分析:

3.1.1 从鉴定、定量、差异三个层面进行关联统计

3.1.2 对定量层面关联结果细分为如下五类,并分别对其做GO/COG/Pathway注释分析:

         蛋白和mRNA表达趋势相同;
         蛋白和mRNA表达趋势相反;
         蛋白无变化,mRNA差异表达;
         mRNA无变化,蛋白差异表达;
         蛋白和mRNA均无变化。

3.1.3 蛋白组与转录组聚类分析

3.2 功能富集关联分析

3.2.1 GO富集关联分析

3.2.2 Pathway富集关联分析

3.3 转录组和蛋白组的Pathway整合图


1、11家实验室SWATH*技术平行性评测

Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry. Nature communications. 2017.

*注:SWATH技术与DIA技术原理相同,同为二级谱采集荷质比范围内全部母离子的碎片离子信息,但不同仪器公司开发此技术时使用的名称有别,故可以理解为同一种技术。

背景:实验结果可重复是科学研究最基础的原则。本文评估了全球11家实验室共同鉴定和定量到的蛋白数据集,其重现性、线性动态范围和灵敏度都非常接近于SRM——蛋白定量金标准。这份数据支持SWATH联合肽段标准打分的分析方法,适合于大范围实验室间全面、重现性好的蛋白组研究。

方法思路

图1

图1 实验设计

30个稳定同位素标记肽段(SIS)分成5组(group A-E),每组6种肽段,每组样本中肽段的稀释浓度从1fmol到10pmol(绿色标记S5),然后将每组肽段稀释4次后混入HEK293样本中(S1-4),获得一系列稀释浓度从0.012到10000fmol。将样本分成相同的11份分发给全球范围内的11个实验室,评估1天、1周内不同地点的数据采集情况。

 

主要结论:

1)蛋白鉴定情况

在全球11个实验室采集的229份SWATH-MS数据中,过滤条件为蛋白水平FDR 1%,共检测到4984种蛋白,4077种蛋白在超过80%的样本中被检测到。

图2

图2  蛋白鉴定的数目和一致性

每种颜色代表一个实验室的所有数据,11个实验室所有数据集的重复性中位数是91.6%(蛋白水平)和79.5%(肽段水平)

 2)定量重现性

经过肽段水平的中位数均一化后,利用4077种在超过80%样本中检测到的蛋白去计算同一天内、不同天内、不同实验室数据采集之间的变异系数,分别是8.3 ± 16.2%, 11.9 ± 17.2%, and 22.0 ± 17.4%。

 图3

图3

图3 变异系数

比较单个实验室一天内、不同天内的CV变化,以及不同实验室间的CV变化

 3)线性和动态范围

利用样本中加入的同位素标准肽段,在每个实验室计算梯度浓度设置的标准肽定量结果线性拟合系数,平均决定系数(R2)是0.97。去除高浓度肽段信号饱和的点,决定系数增加到0.99。在样本之间设置的标准肽理论倍数有9和27,实际检测到的差异倍数是7.49和19.6,主要原因也是高浓度的标准肽已经导致质谱仪信号检测饱和。

 图4 图4

图4 平均峰面积和蛋白水平动态范围统计

平均峰面积图各点连接显示出各实验室间良好的线性指标(图左),蛋白水平动态范围是4.5个数量级范围(图右)

 展望:

  • 目前SWATH-MS蛋白定量技术没有选择最优肽段定量蛋白,是未来优化技术的一个方向。
  • 本研究证明了SWATH-MS适用大规模样本蛋白组学水平的定量,为后续的药物靶点研究、精准医疗提供了必要工具。
  • 大规模样本量的蛋白组学定量,可以与基因组学水平的关联分析,比如基于蛋白表达水平的数量遗传性状研究、基于蛋白表达水平的全基因组关联分析和药物筛选。

2、蛋白定量DIA用于慢性疼痛的研究

Standardized Profiling of The Membrane-Enriched Proteome of Mouse Dorsal Root Ganglia (DRG) Provides Novel Insights Into Chronic Pain. Molecular & Cellular Proteomics. 2016.

背景:慢性疼痛是一种治疗方案有限的复杂疾病。虽对其发病机理进行了多次研究,但各结果间存在较大不一致性,主要受限于传统蛋白质组shotgun技术固有的缺陷。发病机制依然不清晰。

实验设计

  • 炎症性疼痛和神经性疼痛两种模型鼠及其对应control鼠共4组,各3个生物学重复
  • 每个生物学重复由10-13只鼠pooling而成
  • 解剖获得同侧背根神经节膜部分提取蛋白进行DIA蛋白定量

图5

图 5 实验设计类型

CFA慢性炎症性疼痛模型、Veh为其对照;SNI慢性神经性疼痛模型、Sham为其对照

主要发现

1)DDA建库鉴定到3067个蛋白,迄今鉴定数最多的背根神经节蛋白研究。

2)DIA四组都鉴定到的蛋白有2526个,其中CFA和Vehicle都鉴定到的有2581个;SNI和Sham都鉴定到的2600个,表明实验重复性较好。

3)炎症性和神经性疼痛差异蛋白分别为64和77,两种模式共有差异蛋白为12个。

4)其中Serca蛋白在两种模式小鼠中表达量变化相反,表明两种疼痛的调控机制不同。

5)western blot和免疫组化对上述DIA结果进行了验证。

图6

图6 四组实验模型的蛋白聚类分析


1、蛋白鉴定和定量概况

表1 各样本鉴定结果概览

Name

Peptide number

Protein number

N_1

73592

7123

N_2

83437

7720

……

……

……

表2 差异蛋白统计列表

Comparsion group

Down-regulated

Non-regulated

Up-regulated

T-VS-N

381

8005

703

XR-VS-N

242

8369

479

XR-VS-T

137

9020

118


图1  图1

图1 差异蛋白统计图

以Fold change≥2和Q-Value<0.05两个条件作为显著性差异蛋白的筛选标准,得到组间上下调蛋白统计(左图)及火山图(右图)

 

2、质控

 图2     图2

图2 CV分布及主成分分析

根据组内变异系数(CV,左图)评估实验的稳定性和重复性;通过主成分分析(PCA,右图),将同一实验组不同样本间聚合成簇。

 

3、功能分析

 图3     图3

图3 多样本关联分析结果展示

左图,样本相关性分析热图;右图,时间序列分析

 图4

图4 显著富集的pathway统计图

图中x轴富集因子为注释到该Pathway的差异蛋白数除以注释到该Pathway的所有鉴定到的蛋白


表1 组织类样品送样要求

样品类型

送样量

备注

新鲜动物组织干重

≥50mg

富含杂质或蛋白质含量低的样品量干重≥5g,如植物的根、木质部、韧皮部组织等

植物和蕈类真菌(如蘑菇、木耳)类

样品量湿重

≥1g

酵母、霉菌类真菌和细菌、噬菌体等微生物

200mg

新鲜培养细胞数()

≥3~5×106(细胞沉淀体积

30ul~50µl左右)

血液类

血清、血浆≥500µl;全血 ≥5ml

解冻后血细胞会破裂,蛋白溶出来会影响分析,因此一般不建议送全血

表2 蛋白类样品送样要求

样本类型

送样量

蛋白液

≥200μg,浓度≥1µg/µl


Q1:怎样选择标记定量或非标记定量?

标记定量一般用于比较背景相似的样本间的蛋白组差异,若同组比较的样本数≤8,推荐选择iTRAQ标记技术;若同组比较的样本数>8且≤10,推荐选择IBT标记技术。非标记定量技术的限制情况相对较少,无论样本间背景是否相似,若同组比较样本数>10,都可推荐选择非标记蛋白定量DIA;若希望蛋白鉴定数越多越好,或需要鉴定单个样本中的特有蛋白,样本数<10,也可推荐使用DIA。

综上,以下情况可优先选择iTRAQ:

1、定量样本数低于8个(即同时比较的样本数≤8)

2、样本背景极为相似(相同物种和相同的样本类型)

3、经费有限,需要通过高性价比方案完成研究

4、实现更好的重复样本间的定量重复性

更适合选择蛋白DIA定量分析的情况:

1、实验样本数高于10组

2、不同物种、不同来源或部位的样本,需要同时进行蛋白组分析和定量

4、追求更精准的定性定量效果,避免标记和液相分组引入的实验误差

5、需要对采集的数据进行多次分析

介于9-10个样本的项目,推荐华大IBT 10-plex定量产品。

 Q2:蛋白定量DIA和传统的非标记定量有何优势?

传统的非标记定量一般需要通过分级的方法开展,耗时久、重复性差、数据结果可信度不高;蛋白定量DIA技术是新一代非标记定量技术,可通过更优的数据采集模式,在相同时间采集到更丰富的信息,压缩周期的同时,大福度提高样本间平行比较的重复性,数据结果可信度极高。


深圳华大科技(总部)

电话:400-706-6615
邮箱:info@genomics.cn

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