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细菌 de novo 测序
产品介绍
细菌基因组de novo是对细菌基因组测序后从头组装。步骤为先将细菌的染色DNA机械地随机切割成一定相对分子质量范围的片段，根据不同的测序策略，构建对应大小文库，然后进行大规模测序。最终的组装水平根据研究的需要和细菌本身的特点而定，其中最高的指标是一条contig，即基因组的完整序列。
在组装的基础上，进行基因组组分分析，功能注释等分析，推测ORF是否为真实蛋白编码序列，检查功能位点，分析共有序列或特征序列、单个基因或基因间相互作用、表达调控等功能，细菌de novo测序已取代传统方法成为研究细菌进化遗传机制，关键功能基因的重要工具。可以预测重要基因和蛋白以了解其功能和可能机制；在研究病原菌的致病性与疾病的预防和治疗方面，可以鉴定致病相关基因、开发和研究疫苗、开发新型抗生素等；在研究细菌进化方面，可以研究种内进化关系。
产品优势
平台多样：多平台联合应用打造“极致完成图”
交付快速：有完善的分析流程，一键式交付，周期短
附加值高：结题报告文章化，深入挖掘基因组信息
经验丰富：已完成上万个细菌denovo项目，发表细菌基因组文章170多篇。
个性化分析：依据客户需求制定个性化信息分析方案
技术流程
测序策略
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小片段文库 |
Mate-pair 文库 |
PacBio 20Kb文库 |
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细菌denovo |
初级组装 |
1 |
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0 |
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高级组装 |
1 |
1 |
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完成图 |
1 |
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1 |
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信息分析条款 |
信息分析内容 |
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基因组组分分析 |
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基因功能分析 |
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比较基因组分析（需要参考序列） |
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定制化分析 |
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案例一：鼠疫杆菌遗传多样性研究
Historical variations in mutation rate in an epidemic pathogen, Yersinia pestis
期刊：PNAS 发表时间：2013
案例描述：
鼠疫（plague）是鼠疫杆菌（Yersinia pestis,Y pestis）借鼠蚤传播为主的烈性传染病，是广泛流行于野生啮齿动物间的一种自然疫源性疾病，也叫做黑死病。临床上表现为发热、严重毒血症症状、淋巴结肿大、肺炎、出血倾向等。鼠疫在世界历史上曾有多次大流行，在3个有记载的大流行期间导致了大约2亿人死亡，因此被冠上"最具毁灭性传染病"的名头。三次大流行第一次发生在公元6世纪，从地中海地区传入欧洲，死亡近1亿人；第二次发生在14世纪，波及欧洲、亚洲和非洲；第三次是18世纪，传播32个国家。14世纪大流行时波及中国。鼠疫杆菌是鼠疫的病原体，过去的研究表明其由于起源较近，遗传多样性非常有限。
研究结果：
- SNP突变率分析
鉴定出的2,326个单核苷酸多态性（SNPs）中有2,298个SNPs，在进化谱系中仅出现过一次，并根据此构建了MSTree。
- 鼠疫传播路径分析
系统进化树分析结果表明鼠疫起源于中国的青藏高原，其传播途径类似于古代丝绸之路及茶马古道的线路，表明鼠疫的传播与人类活动密切相关。
案例二：结核分枝杆菌群体进化和耐药分析
Genome sequencing of 161 Mycobacterium tuberculosis isolates from China identifies genes and intergenic regions associated with drug resistance
期刊：Nature Genetics 发表时间：2013
材料与背景：
中国12个省份的161株结核分枝杆菌（其中44株敏感菌，94株多耐药菌，23株泛耐药菌）
结果分析：
1. 通过本项研究，获得了我国临床耐药结核分枝杆菌中已知耐药相关基因的突变情况，新发现了与结核分枝杆菌耐药性相关的72个编码基因和28个基因间隔区的突变。
2. 中国地区的结核病人主要受到lineage 2 和lineage 4两系结核分枝杆菌的侵染，而且，其中95%的lineage 2 结核分枝杆菌属于国际上比较关注的北京家族。北京家族的结核分枝杆菌一直被认为有更强的毒性和更容易产生耐药性。
图1. 结核分枝杆菌系统进化分析。从中国12个省份中收集的161结核分枝杆菌的进化分析图。其中，灰色菌株名代表以前公布过的结核分枝杆菌株，蓝色菌株名代表敏感结核分枝杆菌株，黑色菌株名代表多耐药（MDR）结核分枝杆菌株，粉红色菌株名代表广泛耐药（XDR）结核分枝杆菌株。
DNA样本要求
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二代测序 |
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样本类型 |
总量 |
浓度 |
完整性（胶图） |
纯度 |
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基因组DNA |
≤800bp 文库 |
1μg |
12.5ng/μl |
主峰＞20Kb |
无蛋白，RNA/盐离子等污染，样本无色透明不粘稠 |
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2-6Kb mate pair 文库 |
20μg |
100ng/μl |
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10Kb mate pair 文库 |
30μg |
70ng/μl |
主峰＞40Kb |
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≤800bp PCR free 文库 |
10μg |
30ng/μl |
主峰＞20Kb |
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质粒，PCR产物等 |
≤800bp 文库 |
1μg |
12.5ng/μl |
条带清晰无弥散 |
无蛋白，RNA/盐离子等污染，样本无色透明不粘稠 |
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≤800bp PCR free 文库 |
3μg |
30ng/μl |
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三代测序 | |||||||
样本类型 | 总量 | 浓度 | OD | 完整性（胶图） | 纯度 | ||
基因组DNA | 微生物 | 20Kb 文库 | ≥8μg | ≥60ng/μL | OD260/280： 1.6-2.2;OD260/230： 1.5-2.3 | 无降解或轻微降解（主峰在40K附近且弥散不低于20Kb） | 无蛋白，RNA/盐离子等污染，样本无色透明不粘稠 |
Q1. 现在细菌完成图是否会限制基因组大小、GC含量、质粒情况，是否交付质粒信息？
答：目前细菌完成图不再限制基因组大小、GC含量、染色体数目及质粒情况；无需提前评估，都可以按照完成图的策略进行操作（基因组远大于10M的细菌仍需慎重对待）；除了交付基因组组装结果以外还可以从组装结果中识别出质粒序列，并判断是否成环，挖掘质粒相关信息。
基因组大小在10M以内（包括10M或略高于10M）的细菌都可以选择以下策略：
PacBio：20Kb文库，1cell；HiSeq：350bp文库，1G测序数据。
以上针对RSII平台执行的项目，如选择sequel平台，pooling测序会影响质粒组装
Q2. 华大细菌完成图产品有哪些优势？
答：华大细菌完成图目前是用PacBio RSII平台进行测序，无pooling测序，测序产量高，读长长，无样本间交叉污染。
产品组装指标高于同行标准。除了一般承诺的“1 contig, 0gap”，还可以进行以下分析：
成环判定：明确判定细菌基因组序列数目及是否成环
零点确定：确定环状细菌基因组序列起始位点，便于序列比对分析
质粒识别：组装结果中识别出质粒序列，并判断是否成环，挖掘质粒相关信息
甲基化分析：基于三代测序进行甲基化位点分析及对应的motif序列分析
表1. 组装结果示例
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样本名 |
染色体数目 |
Total length (bp) |
GC含量（%） |
ID: circular/linear: length |
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Ⅰ |
2 |
5,706,418 |
45.68 |
Chromosome_1:
circular:3383737 Chromosome_2: circular:2322681 |
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Ⅱ |
2 |
7,699,152 |
70.36 |
Chromosome_1:
linear:7685618 Plasmid_1: circular:
13534 |
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Ⅲ |
1 |
10,397,305 |
70.82 |
Chromosome_1: linear:10397305 |