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蛋白鉴定分析
蛋白鉴定分析，利用质谱技术对细胞、组织、体液或经过分离、纯化、富集后的蛋白胶/液等类型样本中全部或特定的蛋白进行种类鉴定，充分了解特定环境下蛋白质种类情况是进行蛋白质组学研究的基础，为研究疾病发生发展过程以及动植物生长发育状态提供直观的蛋白质种类鉴定结果。蛋白质鉴定分析类产品按研究对象和内容的不同，可分为以下三个产品：蛋白全谱分析，胶点/胶条鉴定和蛋白质分子量测定。
蛋白全谱分析
蛋白全谱分析是对蛋白质组的整体分析方法，通过质谱手段能得到尽可能多的蛋白质信息。主要用于对未知样品中含有的蛋白质种类进行全面的分析。基于质谱技术的蛋白全谱分析，可以为蛋白质高通量的定量和修饰分析提供参考信息。此外，结合全谱分析数据和转录组数据，可以相互补充并共同验证基因注释及功能信息。
胶点分析
双向电泳得到蛋白质图谱，用相关软件分析得到差异或感兴趣的蛋白质点，使用质谱技术对其进行鉴定，得到蛋白质的详细信息。
胶条/蛋白液分析
SDS-PAGE胶中分离出的指定条带或较少组分（一百以内）蛋白液进行质谱鉴定。
图1 胶点（左）胶条（右）图
蛋白分子量测定
通过质谱技术得到较为准确的蛋白质分子量。可对单一组分或多组分蛋白质分子量进行检测，检测范围在1-1000 KD。
产品优势
- 仪器精准：基于高分辨率（大于105）、高质量精度（小于1ppm）质谱平台，确保鉴定结果准确性。
- 高鉴定性：系统全面地研究组织或细胞中尽可能多的蛋白质，可鉴定多达6000种蛋白。
- 适用范围广：无物种特异性限制，理论上可用于所有物种。
产品应用
技术路线
注：蓝色箭头表示全谱分析；绿色箭头表示胶点/胶条分析；灰色箭头表示蛋白分子量鉴定
信息分析内容
信息分析条款 | 信息分析内容 |
标准信息分析 | 1.1 数据产出统计 1.2 蛋白质鉴定结果 1.3 分子量测定结果（仅适用于蛋白质分子量测定） 1.4 蛋白质GO分析（仅适用于全谱分析和胶条鉴定） 1.5 蛋白质COG分析（仅适用于全谱分析和胶条鉴定） 1.6 蛋白质Pathway代谢通路分析（仅适用于全谱分析和胶条鉴定） |
个性化信息分析 | 2.1 单个样本蛋白质相对丰度定量（iBAQ）（仅适用于全谱分析和胶条鉴定） |
定制化信息分析 | 3.1 可结合客户需求，协商确定定制化信息分析服务内容。 |
1、睾丸组织蛋白全谱
Tissue-Based Proteogenomics Reveals that Human Testis Endows Plentiful Missing Proteins. J. Proteome Res. 2015
研究背景：睾丸组织具有较高的基因表达水平，利用质谱技术得到睾丸样本的蛋白全谱信息，对缺失蛋白（Missing Proteins，MPs）进行研究，得到有潜力的biomarker。
实验思路：
- 采用glycine-SDS-PAGE和tricine-SDS-PAGE两种分离方法，对三个睾丸样本进行分离；
- 通过LC-MS/MS对样品进行全谱分析，得到总蛋白鉴定结果。
图1 睾丸蛋白质组全谱分析流程图
主要结果：共鉴定9597个蛋白，此次鉴定是迄今为止睾丸组织鉴定数最高的质谱数据。
图2 睾丸样品的分离和鉴定结果
（A）三个睾丸样本的glycine-SDS-PAGE和tricine-SDS-PAGE；（B）glycine-SDS-PAGE和tricine-SDS-PAGE分离后鉴定的蛋白数量。
2、通过蛋白质组学方法研究印度梨孢菌和油菜的共生互作分子生理机制
Proteomic approach to understand the molecular physiology of symbiotic interaction between Piriformospora indica and Brassica napus. Sci Reprots.2018.
研究背景：许多研究都集中在具良好前景的植物内生真菌上，以保护植物免受营养缺乏和环境胁迫，从而获取更好的发展和生产力；此外，蛋白质数量及质量在很大程度上受基因组、转录组和转录后修饰水平调节。因此，通过蛋白质组学工具开展物种间的互作关系具有极其重要的意义。
实验思路：
- 首先使用MS培养基培养油菜四周并收集其根部；
- 进行蛋白提取并使用LC/MS对蛋白质进行定量及鉴定；
- 通过信息分析将蛋白提交至数据库比对，获取蛋白互作关系及差异表达蛋白。
图3 印度梨孢菌和油菜的共生互作实验示意图
主要结果：鉴定出8123个蛋白，其中在高置信水平条件下(p-value ≤ 0.05, fold change ≥2, confidence level 95%)发现有34个蛋白明显下调，12个明显上调；将所鉴定出的差异蛋白进行图谱绘制，发现大量涉及到代谢过程、共生信号、应激/防御反应、能量产生、养分获取、生物合成的基本代谢产物的基因集群。
图4 GO富集对油菜根部的差异表达蛋白的富集分析
图5 参与能量代谢和蛋白质调控的差异表达蛋白质间相互作用网络
图6 印度梨孢菌和油菜籽植物共生体中与主要代谢蛋白网络相关联的差异表达蛋白(DEPs)的示意图
在蛋白质组学水平上显著检测到的DEPs使用绿色彩云状突出标记。
1. 标准信息分析
1.1 蛋白鉴定结果
蛋白鉴定结果表包含每个样品鉴定到的蛋白具体信息，包括蛋白分组号、蛋白ID号、相对分子质量、等电点、描述信息、鉴定覆盖率、鉴定肽段数、鉴定谱图数以及匹配相同肽段的蛋白质ID。
表1 鉴定蛋白列表
Sample | Total_spectra | Identified_spectra | Identified_peptides | Identified_proteins |
Jurkat | 88053 | 43657 | 16708 | 5129 |
1.2 蛋白质GO分析
图1 蛋白质的GO功能注释
GO分类图显示了三个本体中所涉及到各条目的分布情况，不同颜色标记为三个本体中涉及到的各个条目
1.3 蛋白质COG分析
图2 COG注释结果统计
纵坐标为COG分类条目，横坐标为功能分类对应的蛋白数量。该图表示样品中不同功能的蛋白质的统计数量
1.4 蛋白质Pathway代谢通路分析
图3 KEGG数据库中Endocytosis pathway的详细代谢通路图
红框表示本项目中鉴定到的蛋白
1.5 蛋白分子量测定
图4 单一组分蛋白样品质谱图
横坐标m/z：荷质比，纵坐标Intens：峰度
质谱峰基本信息如下：
M/z | Intens |
3108.076 | 1.5*105 |
1550.199 | 8000 |
图5 多组分蛋白样品质谱图
横坐标m/z：荷质比，纵坐标Intens：峰度
质谱峰基本信息如下：
M/z | Intens |
1752.867 | 6.0*105 |
1892.986 | 5.8*105 |
1956.902 | 4.3*105 |
2033.064 | 3.0*105 |
1612.746 | 1.8*105 |
1. 蛋白样品送样要求
表1 蛋白样品送样要求
样品类型 服务类型 | 蛋白 | 肽段 | 胶点、胶条 | 备注 |
蛋白全谱分析 | ≥500 µg，浓度≥1 µg/µL | 消化前蛋白含量≥50 µg | ___ |
|
蛋白胶条鉴定分析 （包含单一蛋白鉴定） | ≥30 µg，浓度≥1 µg/µL | ≥50 fmol/µL，体积≥10 µL | 考染或银染 肉眼可见 | 银染胶不能含戊二醛；且保证在电泳后一周内进行切胶送样；寄送时在管子里加水，防止胶干燥；-4℃保存，干冰寄送 |
蛋白胶点鉴定分析 | ≥50 pmol | ≥50 fmol/µL，体积≥10 µL | 胶点直径≥1.0 mm； 考染或银染肉眼可见 |
|
蛋白分子量测定 | ≥5 µg，蛋白纯度应>90%，浓度≥1 µg/µL | ___ | ___ |
|
2. 组织列样品送样要求
表2 组织类样品送样要求
送样量 | 备注 | |
动物组织 | ≥100 mg | 植物叶片≥0.5 g；富含杂质或蛋白质含量低的样品量干重≥1g，如植物的根、木质部、韧皮部组织等 |
植物、蕈类真菌（如蘑菇、木耳）、藻类 | ≥1 g | |
酵母、霉菌类真菌和细菌、噬菌体等微生物 | ≥200 mg（菌体约20 µL） | |
新鲜培养细胞数(个) | ≥3~5×106（细胞沉淀体积 约30~50 µL） | 如需进行修饰位点富集鉴定，则需细胞数达到107（约细胞沉淀体积100 µL左右） |
血液类 | 血清、血浆≥500 µL； 全血 ≥5 mL | 解冻后血细胞会破裂，蛋白溶出来会影响分析，因此一般不建议送全血；如直接送提取好的蛋白，请去除高丰度，并附上去除高丰度前后的胶图 |
唾液、羊水 | 低于5mL需要做预实验 | |
尿液 | ≥50 mL | 送样品前用1000 g离心5 min，弃去沉淀 |
脑脊液 | ≥2 mL | 脑脊液如果做多肽组定量不需要去除高丰度蛋白，仅需500 uL |
*发酵液样本请尽量多送。如果样品材料具有特殊性请备注说明，如具有很厚的荚膜、容易氧化等。如样本需要进行富集和蛋白修饰分析，应加大送样量（动物组织、体液为3倍送样量，植物组织为6倍送样量），具体要求请与华大基因销售代表联系。
Q1：蛋白全谱分析鉴定数能达到多少？
A1：蛋白全谱分析鉴定到的蛋白数，与物种、样本中蛋白质含量及复杂程度、实验中蛋白组分分离程度、数据库的完整度都有很大的关系。如植物来源的样本中蛋白质种类通常比动物来源的样本多，动物组织样本中蛋白质种类通常比其血液样本多。一般情况下，一次全谱分析可以鉴定到1000-3000种蛋白。
Q2：双向凝胶电泳与质谱联用鉴定蛋白质的过程是什么？
A2：通过对蛋白质双向电泳的图谱扫描，进行谱图差异分析，找到差异点。把差异点切出，进行脱色、酶解、质谱检测，得到质谱原始数据文件，通过数据库搜索可以得到差异点中的蛋白质的详细信息。
Q3：若跑完的胶采用的是银染染色的方法，请问银染试剂哪些会对后续的质谱鉴定产生影响？
A3：银染试剂里不要使用戊二醛，因为它会对蛋白进行修饰，这样会对后续蛋白的鉴定结果产生影响。