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代谢组与16S关联分析

微生物组的研究已经逐渐进入到多组学的时代,越来越多的科学家将代谢组与微生物组关联起来,同时从微生物与代谢物两个角度分析生物学问题,通过解析微生物-代谢物的关联性,多维的角度揭示生命活动。

华大基因针对宏基因组及代谢组的特征数据差异物种及差异代谢物进行整合分析——对于差异代谢物及差异代谢物分别进行定量关联分析及功能关联分析,对于提供连续表型的数据,还进行差异物种,差异代谢物和表型之间的关联分析,以探究微生物、代谢物和表型的内在关系。

 

技术优势

关联分析研究经验丰富,在Nature等顶级期刊上自主发表多篇文献。

充分调研微生物组与代谢组关联分析文献,自主开发软件分析流程。

 

产品应用

1、  肠道微生物与疾病研究

2、  脑-肠-轴研究

3、  益生菌等微生物制剂开发

4、  根际微生物研究

5、  水体、土壤等环境研究

6、  茶叶、腐乳等发酵食品发酵工艺探索

 

技术路线

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项目周期

12个自然日        

 

 


案例一:噬菌体对小鼠肠道微生物菌群及肠道代谢的动态调控[1]

研究背景:

人体中约有1014左右的微生物,几乎与人体的细胞等量,但对于微生物是怎样影响人体和疾病的还需进一步研究;目前调控人体肠道微生物的手段主要是饮食和抗生素治疗,能更精准和合理地在肠道微生物群中调控微生物的方法还需进一步开发;而噬菌体在肠道微生态中广泛存在,他们可以选择性地侵染和裂解微生物,故研究噬菌体对肠道微生态的影响有助于研发精准调控肠道微生态的治疗方案。

 

技术路线:

对小鼠建模:1.摄入十种微生物的无菌小鼠,给予噬菌体观察;2.摄入9种微生物的无菌小鼠;随时间长度取样,观察微生物及噬菌体含量变化,分析其相互作用网络;做代谢组学实验,分析噬菌体引发的代谢系统变化。

 

主要结论:

噬菌体不仅能影响目标菌株,也能引发微生态中其他微生物的变化;

噬菌体在引入后引发目标菌株含量的下降,并与之共存,同时影响到其他微生物,继而对宿主肠道代谢组产生影响,噬菌体对目标菌株的抑制作用导致目标菌株中抗性菌株的比例上升。

揭示了微生物间的相互作用及噬菌体加入引发的级联效应。噬菌体的引入会导致其他非目标微生物的量发生变化,但没有一个微生物完全消失(Fig 1A);两次噬菌体的引入引起不同的系统级联反应,第一次T4及F1的引入导致了B. vulgatus, P. mirabilis, 和A. muciniphila含量的迅速上升, P. distasonis 和 B. ovatus含量的缓慢上升以及B. fragilis含量的缓慢下降,第一次B40-8及VD13的引入则没有引起肠道微生物菌群的显著变化,仅有E. coli 和 C. sporogenes的含量显示了微小的升高(Fig 1B)。

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图1 A. 微生物丰度在噬菌体加入前后的变化;B. 模型小鼠的肠道微生物的Bray-Curtis相异度,上图表示5个小鼠中任意2只间的相异度,下图表示5只小鼠分别与其前一天sample对比的相异度

 

肠道代谢物的变化可以反映肠道微生物菌群组分的变化。

噬菌体的引入导致会目标菌株含量的下降,继而引发了与目标菌株唯一相关的代谢物的表达下调;而与多个微生物代谢途径相关的代谢物的表达也发生了显著变化;

 

案例二:微生物与代谢关联揭示拟南芥三萜化合物对植物根系微生物组的调控规律[4]

研究背景:

在自然界中,植物的生长状态不仅与所处环境密切相关,也与种类繁多的根系微生物紧密关联。据估计,植物将20%的光合产物用于根系化合物的合成,但这些化合物是否参与植物与根系微生物的互作过程,是否直接特异性的调控根系微生物,尚不十分清楚。

三萜类化合物是植物特异的代谢物,它们的功能包括在植物防御、信号,及抗微生物活性。它们是植物天然产物中数量最大且结构最多样的家族之一。

 

技术路线:

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图2 技术路线图

主要发现:

与野生型相比,拟南芥三萜化合物合成突变株的根微生物组成和多样性发生了变化。16S分析,在门和OUT的分类水平上,突变型与野生型相比,显示Bacteroidetes拟杆菌门富集与Delatproteobacteria变形菌门消耗的微生物调节模式。同时将其根部微生物与分类上较远物种水稻和小麦的根系细菌分布相比较,发现这些三萜化合物的生物合成途径影响拟南芥根部微生物组的组成。

代谢组分析发现拟南芥野生型及THAS过表达植株的根系中存在7种thalianol衍生产物(T1, T2, T9, T10, T18a-T18c)及arabidin (A5)在野生型型植株中不存在。

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图3 三萜通路的突变体特异调控的根系细菌类群

在三种主要的细菌门(Proteobacteria,Actinobacteria和Firmicutes)中选择了19种菌株分离纯化与三萜混合物培养,大多数Proteobacteria菌株增殖更快,而所有Actinobacteria菌株都被抑制,显示植物根部与土壤中的浓度和消耗模式一致,表明所试验的化合物有助于植物根际细菌的主动选择。

对代谢敏感细菌属进行单个化合物的培养实验,在 A388 菌株单独加入三萜类化合物或三萜类化合物的混合物进行培养后,丰度增加。而A224菌株在加入 T2、T9、T10、A5 以及混合物进行培养后,生长受到抑制,而加入 T18a、T18b、T18c 进行培养后,有促进生长的作用。表明三萜代谢物可以选择性地调节这些根系细菌的生长。

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图4 代谢物对根系细菌的效应和细菌介导的化学转换

 

参考文献

[1] Hsu, Bryan B., et al. "Dynamic modulation of the gut microbiota and metabolome by bacteriophages in a mouse model." Cell host & microbe 25.6 (2019): 803-814.

[2] Huang, Ancheng C., et al. "A specialized metabolic network selectively modulates Arabidopsis root microbiota." Science 364.6440 (2019).


代谢组与16S关联分析首先将属于两组学的特征数据被挖掘出来,并依据特征数据的不同分别从代谢物整体表达、代谢通路及差异代谢物三个层面关联微生物,层层递进,既可以对代谢物与微生物之间的关联性进行初步探索性分析,又可以在确定相关性和组间差异后,进行生物标记物筛选

以下为部分分析结果图片展示:

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1、  适用数据类型

要求用于关联分析的两组学的样本数据一一对应(即用于关联分析的两组学的样本来自于相同的生物学重复个体),代谢组数据可以为非靶向代谢组、脂质组学、靶向代谢组学中的任意一种。

 

2、  重复次数要求

1)当样本为2组时,每组样本数不少于8个;当样本组不少于3组时,每组样本不少于4个;每组样本大于10个时分析效果较好。

2)用于关联分析的临床样本推荐每组样本数不少于30个。

3)重复数少于建议数时分析效果差(样本总数少会导致WGCNA降维效果差,而重复数少则导致相关性分析统计不可靠,后续分析流程收到影响);每组低于3个样本时无法分析。

Q1:为什么用于关联分析的两组学样本要求一一对应?

A1:分析中包含Spearman相关性分析,其相关系数表明X(独立变量)和Y(依赖变量)的相关方向,在进行计算两组学的相关性时要求每一个组学数据要有能够对应的另一个组学数据,否则无法进行相关性分析。

 

Q2:16S+代谢关联分析对用于采集数据的样本有限制吗?

A2:没有限制。此关联分析针对16S及代谢组数据,满足条件的数据即可进行相应的关联分析,根据解读关联分析的结果进行数据挖掘,因此要求在前期设计实验时就要考虑到后面用于关联分析的两组学数据的样本来源在生物学上的相关性(一般建议用于关联分析的两组学数据来源于相同的生物学重复的个体),单纯的数据分析本身只讨论统计学的相关性。

 

Q3:对于关联分析的两组学数据的重复数的要求有什么依据吗?

A3:关联分析是依据16S及代谢组数据基础上进行的统计关联分析,故用于关联分析的样本数据越多,分析结果表现越好。

建议数是我们的项目经验值,当重复数低于建议数时,数据分析的表现结果差(样本总数少会导致WGCNA降维效果差,而重复数少则导致相关性分析统计不可靠,后续分析流程收到影响);且每组低于3个样本时无法进行关联分析。


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