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免疫组库测序

        T/B细胞是适应性免疫系统的两大细胞群,细胞表面受体TCR/BCR存在一块区域叫互补决定区(Complementary Determining Region, CDR),包含CDR1、CDR2、CDR3,其中CDR3最高变,在抗原识别中起关键作用。华大的免疫组库测序是通过多重PCR和高通量测序技术,分析编码CDR3区的DNA/RNA序列,获得机体的免疫特征。

免疫组库图示
图1 免疫组库图解

产品优势

一站式服务:提供从CDR3的扩增、建库、测序、后续信息分析以及数据挖掘一系列全方位的服务;

有针对性的研究方法:针对CDR3的V区及J区两端设计引物,目的扩增CDR3区域;

扩增偏好性低:采用两步法建库,并优化引物配比,将扩增偏好性降低约70%;

可重复性高:同一样本建库两次克隆一致性高;

重复性
图2  同一样本实验重复性评估(Hiseq)

更丰富的分析结果:新增多种结果统计图表;新增V/J基因频率分布统计、多样品聚类分析、共性分析、差异分析;新增四种多样性评估指标;

更友好的xbio结题报告展现形式:全新升级的结题报告界面友好,对分析方法及结果解释详尽,图表按照发表文章要求展示,让您一目了然;

更真实的克隆定量信息:将低质量reads与高质量克隆进行比对,挽回重要数据,让克隆定量信息不丢失;

更强的纠错能力和错配处理能力:利用多层聚类方法,纠正PCR和测序引入的错误;错配处理能力提升,更适合分析BCR的高突变区域。

 

 产品应用

 免疫组库应用2

 

服务内容

目的链

目标区域

样品类型

扩增方法

测序策略

TCRα 或 TCRβ

CDR3

DNA 或 RNA

M-PCR (VJ)

PE150

BCRH 或 BCRL

CDR3

DNA 或 RNA

M-PCR (VJ)

PE150

BCRH (鉴定抗体亚型)

CDR3

RNA

M-PCR (VC)

PE150

 

信息分析内容

1、基本数据统计


     数据过滤,对原始数据进行去除接头污染及低质量reads的处理

     数据搭建,数据拼接,消除测序背景及有效数据构建

     数据统计,数据产出统计及测序数据的成分和质量评估

2、数据比对分析

     比对分析,与数据库V/D/J基因片段比对

     比对结果统计

3、克隆序列特征注释

    CDR3区核酸序列和氨基酸序列

    鉴定无效序列(包含终止密码子,超出结构范围)

    鉴定单碱基突变(替换、删除、插入)(for BCR)

4、单样品克隆群体特征分析

    CDR3序列长度分布

    V/J基因频率分布

    V-J基因组合频率分布(3D, Circos)

   克隆群体结构分析(频率分布,D50曲线,甜甜圈图)

5、样品间比较分析


    测序饱和度分析

    克隆多样性分析(辛普森系数、香农威纳系数等)

    样品间共有克隆分析

    聚类分析(层次聚类,MDS聚类)

    组间差异分析


肿瘤案例: TCR克隆异质性与新抗原异质性及肺癌复发的关系

Cancer Discovery. 2017 Oct;7(10):1088-1097.

研究目的:寻找免疫检查点(PD-1、CTLA-4)治疗疗效的biomarker

研究样本:11例未转移肺腺癌,共45 tumor regions (2 to 5 regions per tumor)

研究技术:WES、TCR sequencing

研究结果:病灶特有突变导致新抗原(neoantigen)的内部表达差异,因此,产生不同的免疫原性,形成了TIL克隆内部差异(TCR ITH)。TCR ITH(intratumor heterogeneity)高与术后疾病复发和低生存率有关。 

 案例图1

图1 TCR克隆异质性(ITH)与肺腺癌基因组和临床的相关性

(A)年龄与MOI相关性;(B)新抗原与MOI负相关;(C)复发的病人具有更高的TCR ITH(lower MOI);(D)MOI越高(TCR克隆多样性越低),病人的无病生存期(disease-free survival)越长。MOI:克隆重叠指数,范围0-1,0代表克隆完全不同,1代表克隆完全相同。

 

感染类疾病案例:TCRβ序列特征可准确预测CMV感染状态

Nature Genetics. 2017, 49(5): 659-665.

研究目的:确定是否可以用TCR特征预测CMV(巨细胞病毒)感染状态。

研究样本:群体1:共计666个样本,其中289个CMV阳性,352个CMV阴性,40个感染状态未知;群体2:120个验证样本。

研究结果:对289个CMV+和352个CMV-样本进行免疫组库测序,发现了CMV相关的TCRβ序列特征,并且利用TCRβ可以从666个研究样本和120个验证样本中,准确鉴定出CMV感染状态。研究还发现该群体的TCRβ与HLA-A或HLA-B显著相关。

案例图2

图2 TCRβ可预测CMV感染状态

(a)CMV+和CMV-样本中unique TCRβ分布散点图。(b)ROC曲线显示TCRβ作为CMV感染状态分类器的分类效果。其中虚线表示在群体1中的测试结果,短虚线代表群体1中的交叉验证效果,实线代表群体2中独立验证效果。每条线上的黑圈代表最大后验概率(MAP)的决定阈值。插入图表展示的是群体2中MAP分类效果,敏感度为0.90,特异性为0.89。

 

自身免疫性疾病案例:杀伤T细胞的突变积累可能与类风湿性关节炎发病有关

Nature Communications. 2017, 8:15869.

研究目的:大颗粒淋巴细胞白血病(LGL)常合并发生类风湿性关节炎(RA),研究发现LGL病人的CD8+ T细胞克隆存在STAT3突变,而拥有该突变的LGL病人更容易并发RA(43% vs. 6%)。因此推测,发生体细胞突变的CD8+ T细胞可能与RA发病有关。

研究样本:82例新诊断未治疗的RA病人,20例健康人,取外周血。

研究结果:首次采用CD4+ T细胞做对照,过滤生殖系突变(germline mutations),对分选的T细胞进行目标区域测序、外显子测序和TCR β链CDR3测序。发现,大约20%(5/25)病人的CD8+ T细胞有体细胞突变(somatic mutations),而CD4+ T细胞没有,RNA-seq确认了突变基因在CD8+ T细胞中高表达。功能分析发现,这些基因突变与免疫调控、细胞增殖有关,因此推测,发生体细胞突变的CD8+ T细胞可能与RA及其他自身免疫性疾病的发病有关。

 案例图3

图3 病人1中CD8+ T细胞的克隆分布及突变

(a)利用TCR测序获得的CD8+ T细胞克隆分布。(b)病人1中存在两个高频克隆,经过免疫抑制治疗后仍高表达。(c)利用扩增子测序,在流式分选后的亚群中进行突变验证。(d)本文研究思路图。

 

华大基因已发表IR-seq相关文章

研究内容

发表时间

发表期刊

影响因子

文献标题

肝癌亚型差异分析

2015.04

Oncoimmunology

7.72

Identification of characteristic TRB V usage in HBVassociated HCC by using differential expression profiling analysis

分析软件

2015.08

Genetics

4.56

IMonitor: a robust pipeline for TCR and BCR repertoire analysis

骆驼

2016.09

PLoS One

2.81

Comparative Analysis of Immune Repertoires between Bactrian Camel's Conventional and Heavy-Chain Antibodies

实验方法学

2016.03

PLoS One

2.81

Systematic Comparative Evaluation of Methods for Investigating the TCRβ Repertoire.

肝癌

2015.07

Cancer Letters

6.38

Immune repertoire: A potential biomarker and therapeutic for hepatocellular carcinoma

原发性胆汁性胆管炎

2016.09

Journal of immunology

4.86

Clonal Characteristics of Circulating B Lymphocyte Repertoire in Primary Biliary Cholangitis

微小残留病

2016.10

Frontiers in Immunology

6.43

Minimal Residual Disease Detection and Evolved IGH Clones Analysis in Acute B Lymphoblastic Leukemia Using IGH Deep Sequencing

预测V/J基因软件

2016.11

Frontiers in Immunology

6.43

IMPre: An Accurate and Efficient Software for Prediction of T- and B-Cell Receptor Germline Genes and Alleles from Rearranged Repertoire Data

乳腺癌、癌旁和淋巴结的TCR分析

2017.02

Cancer Immunology Research

8.28

The Different T-cell Receptor Repertoires in Breast Cancer Tumors, Draining Lymph Nodes, and Adjacent Tissues

结肠腺瘤和结肠癌浸润淋巴细胞

2017.05

Journal of immunology

4.86

Characterization of the B Cell Receptor Repertoire in the Intestinal Mucosa and of Tumor-Infiltrating Lymphocytes in Colorectal Adenoma and Carcinoma

免疫缺陷

2015.12

Human Molecular Genetics

5.99

DCLRE1C (ARTEMIS) mutations causing phenotypes ranging from atypical severe combined immunodeficiency to mere antibody deficiency

肾移植

2016.11

Transplant Immunology

1.32

T cell repertoire following kidney transplantation revealed by high-throughput sequencing


分析内容图1

图1 克隆群体特征分析

A,V-J基因组合频率Circos图,每个颜色块代表一种基因,颜色块越宽,频率越高。色块间的连线代表一种V-J基因组合方式。B,克隆频率分布,横纵坐标分别为克隆数和克隆频率。C,克隆频率分布甜甜圈图。第一层为1个reads、2个reads及≥3 reads支持的克隆类型比例;第二层为≥3 reads支持的克隆类型中,top 20%、20%-40%、40%-60%、60%-80%、80%-100%克隆的累积频率分布;第三层为top5克隆类型的频率分布及对应的氨基酸序列。D,Top20 V基因频率组间分布柱状图。


表1 免疫组库DNA/RNA送样建议

样本类型

总量

浓度

RIN

28S/18S

基线和5S

纯度

Sorted T cells RNA / PBMCs RNA

≥500ng

≥35ng/μL

RIN≥7.0

28S/18S≥1.0

基线平整,5S峰正常

无DNA,蛋白/盐离子等污染,样本无色透明不粘稠

Whole blood RNA/ Tissue RNA

≥1μg

≥70ng/μL

RIN≥7.0

28S/18S≥1.0

 

表2 免疫组库组织送样建议

组织类型

提取DNA建议送样量

提取RNA建议送样量

分选细胞

≥1×106

≥2×105

新鲜动物组织干重

≥200mg

≥30mg

全血

≥2mL

≥ 1 mL全血收集的淋巴细胞or ≥ 1 mL Paxgene Blood RNA tube / RNAprotect® Animal Blood Tubes收集的全血

注意:对于组织样品,若淋巴细胞含量低,存在扩增不出来的状况。


Q1: TCR和BCR各条链编码基因的区别?推荐哪条链?

TCR Beta链和BCR重链是由V、D、J基因编码的,而TCR alpha链和BCR轻链是由V、J基因编码的。从发表文章来看,研究TCR beta链和BCR重链的比较多。

Q2:免疫组库测序可以区分IgG、IgM、IgD、IgE吗?

免疫球蛋白的亚型,通过C区序列可以区分,华大有相应的引物,但必须是RNA样品。利用多重PCR的方法,利用V区-C区的引物,用约30bp的序列区分。产物长度大约是在200-300bp。

Q3:免疫组库的测序深度?能得到多少序列?

分析数据显示,数据量的增加,主要影响低频克隆,并且这些克隆的排序在一千多到九千不等,而研究往往只关注top100的克隆和疾病的关系,所以推荐起始数据量1G raw data。但如果客户想关注更多低频克隆,可以加大测序数据量。

Q4:做免疫组库测序,用基因组DNA做模板好,还是RNA好?

DNA水平侧重于研究基因重组信息,RNA水平侧重于研究基因的表达状态。使用DNA和RNA做模板各有优缺点:

gDNA的优点是:

1)因为每个基因只有两个拷贝,因此可准确地反映免疫细胞受体的克隆数;

2)DNA更稳定,易储存。

缺点是:

1)由于copy数不高,模板含量低,因此可能需要更多的样品;

2)由于J区和C区之间有很大的intron区,受测序长度的局限,缺少特异性扩增引物来扩增CDR全长。

RNA的优点是:

1)J区和C区之间无intron,可用C区进行引物设计,扩增全长CDR;

2)由于表达丰富,模板含量高,样品消耗量少。

缺点是:

1)免疫细胞受体的克隆性受到mRNA表达高低的影响,不能客观地反应本身的克隆数;

2)RNA不如DNA稳定,样品保存和操作要求较高。


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