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目标小分子定量

       代谢组学(Metabonomics/Metabolomics)是继基因组学和蛋白质组学之后新兴发展起来的学科,其主要目标是定量地研究生命体对外界刺激、生理病理变化以及基因突变而产生的体内代谢物水平的多元动态反应,其研究对象是相对分子质量 1000 DA以内的小分子物质,如脂类、酮类、有机酸等。

       目标小分子定量分析产品,利用多反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)技术,同时对样品中多种目标小分子的含量进行快速、精确地测定。MRM技术作为一种质谱检测的分析方法,具有特异性强、灵敏度高、准确度高、重现性好、线性动态范围宽、自动化高通量的突出优点,这些特质能够满足今天很多研究、临床领域的迫切需要。利用MRM技术进行实时的定量监测可用于药代动力学研究、临床诊断、违禁药物检查、食品化妆品等工业质量控制、环境检测、农药残留,小分子生物标志物验证等相关研究。

        MRM技术是基于三重四级杆质谱仪原理,根据已知信息或假定信息设定质谱检测规则,对符合规则的离子进行信号记录,去除大量不符合规则离子信号的干扰,从而得到质谱信息的一种数据获取方式。

图1

图1 MRM工作原理

 样品经过液相分离系统进入质谱仪进行检测。第一重四级杆(QuadrupoleQ1)只允许特定荷质比的化合物离子(母离子)通过,第二重四级杆(Q2)诱导母离子碰撞得到化合物的碎片离子,第三重四级杆(Q3)只允许特定荷质比的碎片离子(子离子)通过,并且记录子离子信号。MRM技术通过对母子离子对(Transition)的选择,去除干扰离子,降低化学背景,提高物质定量灵敏度。

产品优势

通量高:一次上机检测,可同时得到多种小分子的定量信息。

准确性高:通过对目标小分子母子离子对的选择,去除干扰离子,靶向精确定量。

重现性好:质谱信号重现性差在一定程度上是因为复杂生物样本基体和共流出组分对待测分子离子化、质谱信号的抑制及源内碰撞碎裂过程的影响导致,而在 MRM技术质谱信号采集中,后两者的影响被大大降低,因此重现性也相应提高。

产品应用

图2

技术路线

图3

信息分析

1、标准信息分析

1.1 Transition对选择

1.2 标准曲线绘制(绝对定量)

1.3 数据质控

1.4 目标小分子定量结果

1.4.1 数据分布

1.4.2 比较组分析

1.5 表型分析(仅适用于pannel类型目标小分子定量分析产品)

 

2、定制化信息分析

可结合客户的需求,协商确定定制化信息分析服务内容,包括区分同分异构体等。


1、代谢组学联合宏基因组学对汉族人群肥胖机制进行研究

Gut microbiome and serum metabolome alterations in obesity and after weight-loss intervention. Nature medicine. 2017

背景:肠道微生物的组成和变化会受到许多因素的影响,比如年龄和饮食,然而还有一个平时可能被大家所忽略的因素就是种族。因此,这项以中国汉族年轻人为样本的研究,对我国肠道微生物与肥胖研究领域来说有着十分重要的意义。本研究是上海交通大学瑞金医院和华大基因共同完成的。研究人员以中国的汉族年轻人为研究对象,确定了一个能抑制肥胖的肠道微生物——多形拟杆菌,还研究了其对代谢产物氨基酸水平的影响。

 

技术路线:

图1

主要结论:

1)肥胖志愿者的拟杆菌属细菌大量减少,是因为代谢产物芳香族氨基酸(AAA)以及支链氨基酸(BCAA)的增加;这两类氨基酸在过去的研究中已经被证明与II型糖尿病的发生发展有关。

2)肥胖人群中谷氨酸的含量非常高,与苗条人群的差异也最大,而且在肥胖人群中,它的含量与多形拟杆菌的数量呈反比。

3)多形拟杆菌、谷氨酸含量与肥胖的关系进一步在小鼠模型和人体中进行了确认。

屏幕快照 2018-05-11 下午4

图1 肠胃微生物种类与循环氨基酸的相关性分析

a 217MLGs和7个氨基酸之间的斯皮尔曼系数;b上图,与MLGs关联的血浆中谷氨酸盐水平及其代谢通路参与基因;b下图,对照组与肥胖组个体KO富集差异。

2、采用目标小分子预测T2D患者罹患心血管疾病发病风险

Plasma lipidomic profiles improve upon traditional risk factors for the prediction of cardiovascular events in type 2 diabetes. Circulation. 2016

背景:T2D已经成为世界范围内严重影响健康的主要疾病,CVD是T2D的主要并发症且致死率很高。传统预测T2D患者是否罹患CVD的方法均存在各种各样问题,无法进行准确预测。

实验方案:本文选取3779个二型糖尿病(T2D)患者血浆,且都有不同程度的心血管疾病(CVD)发病风险或死于CVD或有大血管疾病史;采用液相色谱串联质谱对22类、310个脂质进行目标小分子检测。采用加权回归算法计算脂质含量预测未来5年罹患或死于心血管肌病的关系;采用赤池信息量准则优化包含传统脂质预测风险因素在内的多变量模型;5倍交叉验证模型中计算C统计和净重新分类指数(NRI)。后续验证阶段在LIPID队列511个样品中进行。


主要结论:

1)发现鞘脂、磷脂、胆固醇脂和甘油糖脂与未来罹患心血管疾病存在关系;

2)在14种传统预测风险因素基础上加入另外7种脂质能更好的预测罹患CVD的风险;加入另外4种脂质能更好预测CVD的死亡率;

3)脂质可以作为生物靶标对T2D中的CVD进行风险分级,采用目标小分子检测可以进行脂质标志物的筛选。

屏幕快照 2018-05-14 上午10

图2 脂质大类/亚类与未来心血管疾病的风险相关性

采用加权回归鉴定脂质大类/亚类和未来发生心血管事件的风险(n=698,空心环)以及未来发生心血管死亡的风险(n=355,实心菱形)。风险率经过一系列表型和遗传因素的矫正。

 


1、方法建立

1.1 MRM质谱方法的建立

通过对质谱参数如母离子(Q1),子离子(Q3),CE,DP,EP,CXP等进行选择并优化。最终每个目标分子选择3~7个信号响应最好的transition。

      

       图片1      

 图1 MRM质谱方法建立

左上,目标分子一级质谱全扫描;右上,PI子离子扫描模式下,目标分子的二级质谱全扫描,选定强度较高的子离子作为候选;左下,目标小分子的CE优化,横坐标是CE能量值,纵坐标为离子信号强度;右下,正离子模式下的目标分子MRM质谱方法列表

 

1.2 MRM色谱方法优化及LC-MRM方法验证

在选择transition并建立质谱检测方法后,还需优化液相色谱条件,获得稳定可靠的LC-MRM色谱-质谱联用方法用于样本定量检测。

          图片5       

图2 色谱优化过程中的色谱图

左图,标品混合物中目标分析TIC图;右图,标品混合物检测时某个目标小分子的色谱峰图

 

1.3 标准曲线

通过预实验检测样本目标分子MRM信号,预估目标分子大概浓度范围,以估算浓度点为中间值,左右再选择合适的浓度点共8个浓度点建立浓度-峰面积响应标准曲线,每个浓度点3次重复。通过标准曲线,对样本中目标分子进行绝对浓度定量。

屏幕快照 2018-05-14 下午4

图3 目标分子标准曲线拟合

横坐标为分子浓度值,纵坐标为质谱响应值。

 


1.4 LOD(最低检测下限)和LOQ(最低定量下限)

通过标准品的检测结果,评估LC-MRM方法检测目标分子的LOD和LOQ。

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图4 LOD

横坐标时间,纵坐标为强度值

      屏幕快照 2018-05-14 下午4

图5 LOQ

同图4

 

2、样本检测

根据前期实验建立好的方法,开展具体样本的目标分子定量检测。

屏幕快照 2018-05-14 下午4

图6 目标分子的色谱图

                                       

 




1、代谢样品

一般不推荐客户送提取好的代谢物样进行检测,如果客户确已提取好了,需送代谢物样本进行预实验检测。

 

2、代谢组织样品

表1 代谢组织类样品送样要求

样品类型

送样量

备注

组织(动植物)

≥100mg

总重量最低不低于50mg

酵母、霉菌类真菌和细菌等微生物

≥10mg;菌液≥20µL;细胞个数≥107个

必须经过淬灭(即将微生物迅速用液氮或者有机溶剂(-40℃)灭活,使其代谢瞬间停止)

生物体液(血浆、血清)

≥200 µL

总体积最低不低于100 µL;血浆为采用抗凝剂抗凝后, 除去血细胞的液体;血清为血液凝固后的上清液

生物体液(尿液)

≥1mL

总体积最低不低于200 µL;尿液需新鲜,未做任何处理

粪便

≥100mg

不能有粪便储存液,直接-80℃冻存

*所有样本均需在采集后,立即置入液氮中速冻,-80℃低温冷冻保存,干冰寄送;建议送样量能满足实验的所有测试需求,最低送样量有一定风险,具体是最终实验结果为准。

 

3、客户选定的目标小分子,需要随样本同时寄送相应标准品至华大。推荐采购sigma公司的标准品。


Q1:如何选择母子离子对?

A1:一个母离子可能对应多个子离子,在实验方法建立过程中,每个目标化合物会提供两个最佳母子离子对,其中一个用于定性,同时会根据标准品的色谱保留时间排除假阳性结果。

Q2:标准曲线如何制作?

A2:选取不同浓度的标准品溶液(默认8个点),根据标准品浓度和标准品MRM信号响应峰面积拟合直线方程。得到标准曲线。

Q3:MRM技术进行质谱时,可以一次监测多少个母子离子对?是只能对一个特定分子监测,还是多个特定分子同时监测?

A3:MRM检测可实现多个目标分子的同时检测,最大限度节省时间,提高检测效率,每个工作循环最多能处理300对母子离子对,使用Schedule MRM可达700对母子离子对。

Q4:MRM在做定量方面有哪些优势?

A4:高通量:能实现大规模样本的定量分析;高灵敏度:定向分析,排除背景噪音干扰;准确度高,重现性好。

Q5:华大如何减少实验误差,提供数据的质量?

A5:会在实验过程加入内标校正实验误差,并为客户提供严格的QC质控确保数据的真实可靠.

Q6:是否需要提供同位素内标的标准品?

A6:同位素内标能校正实验误差,可以提供准确的定量结果,是目前绝对定量普遍采用的实验策略;也可根据客户需求合理设置其它内标,减少实验误差。


深圳华大科技(总部)

电话:400-706-6615
邮箱:info@genomics.cn

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