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全转录组

          全转录组高通量测序,采用去核糖体链特异性建库方法和小片段富集筛选建库方法,可实现编码RNA和编码RNA的建库、测序、信息分析及联合分析、ceRNA等,从而快速全面准确地获得与特定生物学过程(例如发育、疾病等)所有大RNA转录本数据信息,这一项研究将调控机制研究延伸到“ 网、多层面”结合的立体模式,有助于相对全面解读生物学现象。

推荐方案

推荐两种测序策略方案:

1) 经济型模式-两种文库测序:LncRNA-Seq + Small RNA

大RNA研究:采用LncRNA-Seq测序模式,即采用去核糖体链特异性建库模式,进行PE101测序模式,10G Clean data;实现lncRNA、mRNA、CircRNA鉴定和定量、以及功能分析;

小RNA研究:采用富集小RNA片段建库方法,进行有方向性的SE50测序模式,20M clean reads,实现miRNA、siRNA以及piRNA鉴定和定量,以及功能分析等;

2) 大容量模式-三种文库测序:LncRNA-Seq+ Small RNA+ CircRNA

大RNA研究:采用LncRNA-Seq测序模式,即采用去核糖体链特异性建库模式,进行PE101测序模式,10G Clean data;实现lncRNA、mRNA、鉴定和定量、以及功能分析;

环状RNA研究:采用去除线性RNA,反向富集环状RNA建库方法,进行PE101测序模式,10G clean data,对环状RNA高深度测序,实现对低丰度的环状RNA鉴定和定量及功能分析;

小RNA研究:采用富集小RNA片段建库方法,进行有方向性的SE50测序模式,20M clean reads,实现miRNA、siRNA以及piRNA鉴定和定量,以及功能分析等; 

以上两种模式,还可以实现大RNA和小RNA互作网络分析,以及内源竞争性RNA鉴定和网络分析。


生物分析思路图

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产品优势

实验严谨

建库工艺稳定,技术重复性高,可接受多种类型样本,total RNA最低起始量低至400ng;

分析全面

包含RNA互作模式,及ceRNA竞争网络分析等,从平面调控研究延伸至立体调控研究;

结果可靠

多轮测试,多种软件预测:采用交并集进行数据分析;

质控严格

实验操作及信息分析操作采用全方位及现金的质量管理体系标准。


产品应用

动植物生长发育的研究

抗逆、抗病虫害调控机理的研究

细胞分化和发育的研究

肿瘤发生发展及转移研究



案例一:biomarker及内源性竞争RNA调控研究——鉴定宫颈癌lncRNA和环状RNA等biomarker及ceRNA分析[1]

研究目的:研究宫颈癌lncRNA和环状RNA致病分子调控机制

研究样本:选取3个病人(HPV16)的宫颈鳞癌组织和癌旁组织。三个生物学重复样本混样(患病 vs 正常)

样本处理: 选取癌组织旁边2cm的癌旁组织,切除后即加入RNA later保护剂中30分钟,随后放入液氮中冷藏。

研究技术: 经济型模式-两种文库测序:

                 *去核糖体建库测序方式-研究mRNA、lncRNA、环状RNA;

                  *小片段建库测序方法-研究miRNA;

研究结果:共鉴定到差异表达的19个lncRNA,99个环状RNA,以及304个mRNA  非编码RNA中鉴定到3个新lncRNA和44个新环状RNA,并对这些差异RNA进行功能富集分析。另外,共表达分析和功能预测中,发现19个差异表达lncRNA在致癌和癌症发展中具有重要作用,ceRNA网络分析表达和非表达RNA的相互作用,研究每一个miRNA靶向作用的lncRNA和Mrna竞争关系。发现一些miRNA可以靶向未知的lncRNA,说明这些非编码RNA可能与宫颈癌有关。

研究结论:此次研究结果表明,非编码RNA将有可能作为宫颈鳞癌治疗和诊断的biomarker。CeRNA网络研究在未来宫颈鳞癌研究中将对编码RNA和非编码RNA的关系及重要作用研究的将是重要的分析工具。                                                                                                   fmicb-08-01720-g005

                                     图1 CeRNA网络分析,包含lncRNA、miRNA和mRNA.

                                  (A)包含所有lncRNA/miRNA和miRNA/mRNA互作关系

                         (B) lncRNA-LNC_000188的ceRNA竞争网络. (C)LNC_000231的ceRNA竞争网络. 

                                       每个节点的大小与每个节点的计算功能连接性成比例


案例二:biomarker及内源性竞争RNA调控研究——鉴定宫颈癌lncRNA和环状RNA等biomarker及ceRNA分析[2]

研究目的:研究非编码RNA参与调控次级毛囊(SHFs)细胞凋亡发生的分子机制。

研究样本:生物学重复样本-三只羊,绒山羊毛发生长初期阶段和中期阶段(catagen vs. anagen)的皮肤,各三个重复。

研究技术: 经济型模式-两种文库测序:

                  *去核糖体建库测序方式-研究mRNA、lncRNA、环状RNA;

                  *小片段建库测序方法-研究miRNA;

研究结果:共鉴定到1122个已知和403个新lncRNA,其中173个lncRNA差异表达;另外鉴定到3500差异表达的Mrna表达转录本;411个已知miRNA和307个新miRNA,包含72个差异表达miRNA;进而对lncRNA的顺势和反试调控靶基因进行鉴定,发现,lncRNA和miRNA在毛囊发育过程之中具有重要的系统调控作用,比如生长中期诱导物因素(TGFβ1和BDNF)是由miRNA-873和lnc108635596 lncRNA-miRNA-Mrna调控网络共同调控。

研究结论:阐明了在皮肤细胞凋亡和抗凋亡的分子相互作用,为毛囊退化提供深入的研究提供指导。    

                                                                           12864_2018_4603_Fig8_

                                                   图2 LncRNA–miRNA–mRNA调控网络图

                    环形表示miRNA、方形表示编码基因、三角形表示lncRNA. 红色代表上调,绿色下调(初期/中期)


参考文献:

[1]  Wang H, Zhao Y, Chen M and Cui J (2017) Identification of Novel Long Non-coding and Circular RNAs in Human Papillomavirus-Mediated Cervical Cancer.Front. Microbiol. 8:1720.

[2] Zhou G, Kang D, et al. Integrative analysis reveals ncRNA-mediated molecular regulatory network driving secondary hair follicle regression in cashmere goats. BMC Genomics. 2018 Mar 27;19(1):222.





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图1 差异表达基因和差异表达miRNA靶基因韦恩图

Target 表示差异miRNA的靶基因,mRNA表示差异mRNA对应的基因

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图2 交集基因的表达量热图

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图3 差异表达miRNA和差异靶基因的调控网络分析静态图

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图4 circRNA与来源基因关系网络图分析静态图

挑选差异表达circRNA与显著差异表达来源基因关系网络图

图中圆形表示环状RNA,正方形表示差异表达的来源基因。 红色表示上调,绿色表示下调

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图5 ceRNARNA网络图

红色表示候选的显著ceRNA、绿色表示靶RNA,紫色表示第二层的ceRNA

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图6 ceRNA—miRNA—mRNA调控网络

红色表示候选的ceRNA,蓝色表示共享的miRNA,绿色表示靶RNA,灰色线条表示靶RNA与miRNA的关系,红色线条表示候选ceRNA与miRNA的关系

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图7 差异ceRNA—mRNA互作网络图

红色表示差异显著上调转录本,绿色表示差异显著下调转录本,灰色表示差异不显著的转录本。点越大表示点连接的关系越多

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图8 差异ceRNA—miRNA—差异mRNA互作网络图

红色表示上调,绿色表示下调,蓝色表示miRNA;亮红色和亮绿色表示上下调ceRNA,按暗红色和暗绿色表示上下调靶RNAy。

红色的线条表示边的起始点是上调,蓝色的线条表示边的起始点是下调

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图9 ceRNA—GO功能注释网络图

深红色表示GO功能,暗绿色表示下调ceRNA,暗红色表示上调ceRNA

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图10 ceRNA—KEGG功能注释网络图

深红色表示KEGG功能,暗绿色表示下调ceRNA,暗红色表示上调ceRNA



样本类型

总量

浓度

RIN

28S/18S

基线和5S

纯度

Total RNA (Human / Rat)-广谱性

≥400ng

≥20ng/μL

RIN≥7.0

 

 

 

 

28S/18S≥1.0

DNA,蛋白/盐离子等污染,样本无色透明不粘稠

 

 

Total RNA (Human / Rat)-大容量型

≥5.4ug

≥20ng/μL

RIN≥7.0

Total RNAPlant/Animal-广谱型

2ug

≥40ng/μL

RIN≥6.5

Total RNAPlant/Animal-大容量型

7ug

≥40ng/μL

RIN≥7.0


Q1:全转录组产品两种技术模式如何选择?

全转录组有两种模式,一种为经济型,即采用两种建库测序模式;一种为大容量型,即采用三种建库测序模式;主要区别在于环状RNA研究方式不同,一个是对环状RNA广谱研究,即对环状RNA表达情况初步研究; 二是对环状RNA单独富集建库测序,即可实现对环状RNA高深度研究,以及低表达环状RNA的鉴定和定量分析等。所以如果选择两种模式,是需要根据研究目的和需求决定的,以及对RNA研究深度需求决定的。

Q2:全转录组送样量要求?

需要根据选择的研究模式决定,是满足两种建库测序模式(LncRNA+Small RNA)总量需求:Total RNA最低起始量400ng ,还是满足三种建库测序模式(LncRNA+Small RNA+CircRNA)总量需求:Total RNA最低起始量5.4ug。

Q3:长链非编码RNA建库测序结果可以用于分析环状RNA吗?

可以,长链非编码RNA建库模式采用去核糖体方式建库,对所获得的RNA进行打断测序,相当于获得全部RNA,即可以进行分析环状RNA表达情况,可应用于分析各物种环状RNA表达谱。

Q4:LncRNA测序数据中mRNA的定量效果如何?

人标品:已知mRNA定量与qPCR定量斯皮尔曼系数达到0.85。


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