1、草鱼柔软和坚硬肌肉的磷酸化蛋白组学分析

Quantitative phosphoproteomic analysis of soft and firm grass carp muscle. Food Chemistry, 2020

研究背景：鱼的肌肉硬度是消费者接受的一个重要质量特征，也是鱼产品生产者、加工商和消费者最重要的质量指标之一，更好的质地使鱼易于加工成高质量的产品。磷酸化蛋白组学分析被证明是一种了解与肉质形成相关的生物过程的有效方法，如肉色稳定性、pH值下降和肌肉糖酵解，但这项技术很少应用于鱼类。

技术手段：磷酸化iTRAQ

实验样品：6个脆草鱼和6个普通草鱼的肌肉组织

质谱仪：Q Exactive™ HF-X (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA)； Proteome Discoverer 1.4

实验结果：在脆草鱼中，鉴定到27个上调和22个下调的磷酸化肽段及其潜在的上游激酶。蛋白互作分析将这些磷酸化蛋白聚类为四组：12个骨骼肌纤维蛋白、1个结缔组织蛋白、3个信号调节蛋白和4个碳水化合物代谢蛋白；肌球蛋白、肌动蛋白、原肌球蛋白、紧密连接途径和糖酵解途径可能有助于增强肌肉硬度。这些结果为蛋白质磷酸化在鱼类肌肉硬度中的作用提供了新的见解，并将有助于提高鱼产品的质量。

图1 脆皮草鱼和普通草鱼肌肉中差异磷酸化蛋白的GO和pathway富集分析

a. GO富集分析； b. KEGG富集分析(Top30)

图2 高度表示它们在各自位置出现的频率，颜色代表了它们的理化性质

图3 磷酸化蛋白质-蛋白质相互作用网络图

红色代表上调，绿色代表下调，蓝色代表上调和下调同时存在

2、通过非标记定量乙酰化蛋白质组学揭示不同基因分型的弓形虫乙酰化蛋白特征

Label-Free Quantitative Acetylome Analysis Reveals Toxoplasma gondii Genotype-Specific Acetylomic Signatures. Microorganisms, 2019

研究背景：弓形虫是一种专性胞内寄生虫，在世界范围内有很高的发病率和死亡率。在欧洲及北美地区， 根据弓形虫的毒性、迁移性及生长速率将其分为4个克隆谱系（I, II, III, 12）。目前关于弓形虫的蛋白翻译后修饰研究都集中在type I RH虫型，其他基因型弓形虫的乙酰化蛋白组特征尚未可知。研究不同基因型的弓形虫的乙酰化蛋白差异，可以为寄生虫的毒力机制研究提供新的理论基础。

技术手段：蛋白乙酰化label free定量

实验样品：3种基因型不同的弓形虫分别是RH(type I，毒性强)、 PYS(Chinese 1，毒性强)、PRU(type II，毒性弱)

质谱仪：Q Exactive mass spectrometer (Thermal Scientific, Chelmsford, MA, USA)； MaxQuant

实验结果：

1）总共鉴定了681个乙酰化位点，771个乙酰化肽段，176个乙酰化蛋白。乙酰化蛋白集中于肌肉收缩、碳水化合物代谢、细胞凋亡和钙信号转导。分别从Type I (RH), Type II (PRU)，Chinese 1 (PYS) 3种类型弓形虫中找到457、188和115个乙酰化蛋白（Fig 1），蛋白乙酰化程度随着毒性强弱依次下降。在三种弓形虫种都鉴定到一些其独有的与寄生虫毒性有关的蛋白：在RH种鉴定到很多独有的MIC蛋白，MIC与宿主吸附及寄生虫移动性有关，敲除MIC可能会导致RH毒性降低；在PYS鉴定到独有的AMA1蛋白，这与寄生虫入侵宿主有关。

图 4 种弓形虫乙酰化蛋白鉴定结果venn图

2）RH乙酰化位点富集到xxxxxKAcHxxxx, xxxxxKAcFxxxx, xxxxxKAcNxxxx及xxxxGKAcSxxxx（Fig 2A），PYS乙酰化位点富集到xxxxxKAcHxxxx, xxxxxKAcFxxxx, xxxxxKAcNxxxx及xxxxGKAcxxxxx（Fig2B），PRU乙酰化位点富集到xxxxGKAcxxxxx，xxxxxKAcFxxxx 及xxxxxKAcHxxxx（Fig 2C）。PRU中缺少乙酰化位点xxxxxKAcNxxxx， 这可能与弓形虫的寄生毒性相关，同时天冬酰胺N是弓形虫的非必需氨基酸，富集位点的不同可能揭示了不同基因型的弓形虫细胞营养不同的获取方式。

图5 三种弓形虫的乙酰化位点分析|

A. RH；B. PYS；C. PRU

3）与RH及PYS相比，PRU并不在丙酮酸代谢途径上富集，丙酮酸的稳态与弓形虫生长及代谢可塑性，这可能是PRU毒性相对较低的原因。

4）在RH vs PRU比较组中，鉴定到15个差异乙酰化蛋白，5个下调，10个上调；在PYS vs PRU比较组中，鉴定到3个差异乙酰化蛋白，1个下调，2个上调。相比PRU及PYS虫型，RH中富集了更多组蛋白乙酰基转移酶及氨基乙酰-tRNA合成酶。组蛋白乙酰化主要提高了RH弓形虫对外界刺激的耐受力而氨基乙酰-tRNA合成酶则与其增殖有关，增强了细胞毒性。

3、通过糖蛋白组分析研究XMEN如何影响免疫蛋白

Defective glycosylation and multisystem abnormalities characterize the primary immunodeficiency XMEN disease. J. Clin Invest. 2020

研究背景：X连锁镁离子通道缺陷原发性免疫缺陷病（XMEN）是由镁转运蛋白1（MAGT1）基因的缺乏引起的，疾病特征为CD4+淋巴球不足、严重慢性病毒感染、以及T淋巴球活化之缺陷。

技术手段：N糖基化蛋白质组研究

实验样品：3个XMEN，3个正常人的T细胞

质谱仪：a Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer (Q Exactive, Thermo Fisher Scientific)； MaxQuant

实验结果：

1） 鉴定了1421个蛋白质，2481个肽段。50%的蛋白质与内质网、细胞膜相关。差异糖基化肽段有105个，属于73个基因，集中于神经功能、糖基化、转运、粘附、免疫力和脂质代谢类。由于缺乏糖蛋白可能是由于蛋白丰度下降导致的，所以同时检测蛋白质组，除了MAGT1外，其他蛋白没有显著变化。由于XMEN有更多的肽段，但更少的糖基化位点，因此可以支持MAGT1缺乏导致糖基化缺失。

图6 N-糖基化蛋白质组学热图及差异糖蛋白功能分类

2） MAGT1转染可以挽救糖基化缺陷的蛋白，这些数据加在一起为XMEN疾病的诊断和治疗提供了重要的分支，为临床和病理生理学提供新的基础。

图7 在XMEN T细胞中通过MAGT1 mRNA转染挽救N-糖基化

4、采用PRM磷酸化激酶定量发现结肠癌转移促进因子-PRPS2

Targeted quantitative kinome analysis identifies PRPS2 as a promoter for colorectal cancer metastasis. J Proteome Res, 2019

研究背景：结肠癌（CRC）是全世界发病率和死亡率的主要原因。它占所有癌症发病率的9%以上，是世界上诊断最频繁的癌症之一（居第三位）。而癌细胞转移是导致结肠癌患者死亡的主要原因，约有一半的结肠癌患者发展为转移性疾病。转移性结肠癌(Ⅳ期)5年生存率小于10%。异常激酶的表达与结肠癌的转移密切相关。因此，通过对结肠癌细胞转移过程中激酶蛋白表达的全面分析，可以系统地了解激酶在调节癌细胞转移中的作用。为了找到结肠癌细胞转移过程中起始调节激酶，在此应用近年来流行的多反应监测质谱技术（PRM）来检测结肠癌转移过程中人类激酶的变化过程。

研究思路：

图8 实验流程图

实验样品：SW 480（原发结肠癌细胞）和SW 620（转移结肠癌细胞）（ATCC）

质谱仪：a Q Exactive Plus quadrupole-Orbitrap mass spectrometer coupled with an EASY-nLC 1200 system； Skyline (version 3.5)

实验结果：

(1) 通过PRM靶向蛋白组技术在SW 480-SW 620中定量到了299个蛋白激酶（如下图），其中有83激酶表达上调，77个激酶表达下调（差异蛋白筛选条件为差异倍数大于1.5倍）。同时用Western blot技术验证了其中5个激酶（(AK2, CHEK1, EGFR, IGF2R和PRPS2）的表达量变化，结果显示其表达量变化与PRM结果一致，证明了PRM蛋白定量的可靠性。

图9 299个蛋白激酶表达情况

(2) KEGG pathway分析表明上调激酶中有12个参与focal adhesion pathway（该通路参与癌细胞转移，已有文献报道，在此不特别关注）；另有10个上调激酶参与purine metabolism通路（已有证据表明在结肠癌后期该通路会被激活），其中PRPS2基因mRNA在37种癌中的1000多种细胞系（数据来源于CCLE数据库）都特异表达上调，表明PRPS2激酶在结肠癌发展中特别重要，故在此将关键蛋白锁定为PRPS2激酶。

(3) 为了证实PRPS2激酶对结肠癌发展的影响，在此使用细胞转移及侵染实验观测其对结肠癌细胞转移及侵染作用，结果证实了PRPS2激酶可以促进结肠癌细胞转移及侵染。

图10 细胞转移及侵染实验（PRPS2激酶）

1、定性结果展示

（1） 鉴定磷酸化肽段

    项目利用磷酸化位点鉴定phosphoRS≥0.75进行过滤。对于真核生物，蛋白磷酸化通常会发生在丝氨酸（S）、苏氨酸（T）、酪氨酸（Y）上，其参与的生物学过程不太相同，发生比例也不一样。

图1 肽段磷酸化位点数分布及磷酸化修饰氨基酸残基分布

（2）磷酸化蛋白GO注释：

      Geno Ontology(简称GO)是一个国际标准化的基因功能分类系统，提供了一套动态更新的标准词汇表（Controlled Vocabulary)来全面描述生物体中基因和基因产物的属性。GO总共有三个本体（Ontology），分别描述基因的分子功能（Molecular Function）、细胞组成（Cellular Component）、参与的生物过程（Biological Process）。

图2 GO功能注释图

GO分类图显示了三个本体中所涉及到各条目的分布情况，不同颜色标记为三个本体中涉及到的各个条目。

（3）蛋白磷酸化修饰KOG注释

    Eukaryotic orthologous groups(KOGs)数据库是一种常用的蛋白功能注释数据库。每个KOG条目都包含一系列直系同源蛋白或旁系同源蛋白(Orthologs or Paralogs)。直系同源蛋白是指来自于不同物种的由垂直家系（物种形成）进化而来的蛋白，并且典型地保留与原始蛋白有相同的功能。旁系同源蛋白是那些在一定物种中的来源于基因复制的蛋白，可能会进化出新的与原来有关的功能。此次KOG注释分析是将所有鉴定到的蛋白BLAST比对KOG数据库，得到相应的KOG注释结果。

图3 KOG注释柱图

纵坐标为KOG分类条目，横坐标为功能分类对应的蛋白数量。该图表示样品中不同功能的蛋白质的统计数量。

（4）KEGG代谢通路注释分析

      在生物体内，不同蛋白相互协调行使其生物学行为，基于Pathway的分析有助于更进一步了解其生物学功能。KEGG是有关Pathway的主要公共数据库（Kanehisa，2008），通过Pathway分析能确定蛋白质参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。

图4 Pathway注释柱状图

  图5 Pathway Map

红框表明有鉴定到的蛋白在该节点发挥作用。

2、定量结果展示

（1）磷酸化蛋白组定量

      磷酸化肽段定量火山图。横轴为肽段定量值（log2化），纵轴为统计检验的P-value（-log化）；分布在该火山图左上右上两区域的肽段为显著差异肽段，既满足差异倍数大于1.5或小于2/3，又满足统计检验P-value值小于0.05。

图6 磷酸化肽段定量火山图

表1  差异磷酸化肽段数目统计

（2） 定量重复性评估

      变异系数（Coefficient of Variation）是衡量各观测值变异程度的一个统计量，其计算公式为：变异系数 C·V =（标准偏差SD/平均值Mean）× 100%；一般来说，CV值越高，其观测值离散程度越大，重复性却差；反之CV越小，离散程度越小， 重复性越好。该图中横轴为CV范围，10%表示CV在0~10%以内的部分， 20%表示CV在10%~20%以内的部分，以此类推。纵轴左侧单位具体肽段数目，右侧单位为比例。

图7 磷酸化肽段定量变异系数(CV)分布图

（3） 差异磷酸化肽段的表达聚类

    系统聚类（Hierarchical Cluster）是将每个样品分成若干类的方法，其基本思想是：先将各个样品各看成一类，然后规定类与类之间的距离，选择距离最小的一对合并成新的一类，计算新类与其他类之间的距离，再将距离最近的两类合并，这样每次减少一类，直至所有的样品合为一类为止。

图8 差异磷酸化肽段的表达聚类热图

图中红色部分代表显著上调的磷酸化肽段，蓝色部分代表显著下调的磷酸化肽段，白色部分代表表达变化不显著的磷酸化肽段。

（4）差异磷酸化蛋白的GO富集分析

    GO功能显著性富集分析给出与所有鉴定到的蛋白质背景相比，差异蛋白质中显著富集的GO功能条目，从而给出差异蛋白质与哪些生物学功能显著相关。如上蛋白质定量部分所述，两样品比较时，当肽段的丰度比即差异倍数达到1.5倍以上，且经统计检验其p-value值小于0.05时，视该肽段所在的蛋白为不同样品间的差异蛋白。

    该分析首先把所有差异蛋白质向Gene Ontology数据库（http://www.geneontology.org/)的各个term映射，计算每个term的蛋白质数目，然后应用超几何检验，找出与所有蛋白质背景相比，在差异蛋白质中显著富集的GO条目。

图9 GO富集分析演示结果

图10 差异蛋白GO功能分类图

x轴代表差异蛋白数目，y轴代表GO注释条目

图11 GO term关系网络图

每一个节点表示一个GOterm，不同颜色分别表示其所属的不同功能分类，红色表示生物过程（biological process）、绿色表示细胞组分（cellular component）、蓝色表示分子功能（molecular function）。深色表示显著富集的GOterm，浅色表示富集不显著的GOterm，灰色表示没有富集的GOterm。类似有向无环图，从中可以看出各个GOterm之间的关系，实线箭头表示包含关系，虚线箭头表示调控关系，红色虚线表示正调控，绿色虚线表示负调控。（通过网页图可以自由选择或者调整基因的位置。）

（5）差异磷酸化蛋白的Pathway富集分析

    Pathway显著性富集分析方法同GO功能富集分析，是以KEGG Pathway为单位，应用超几何检验，找出与所有鉴定到蛋白背景相比，在差异蛋白中显著性富集的Pathway。通过Pathway显著性富集能确定差异蛋白参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。

图12 Pathway富集分析演示结果

Pvalue<0.05的为显著富集的Pathway代谢通路。

图13 差异蛋白Pathway分类统计图

x轴代表差异蛋白数目，y轴代表Pathway注释条目。

图14 显著富集的Pathway统计图

该图给出了差异蛋白显著富集的Pathway代谢通路，图中X轴富集因子（RichFactor）为注释到该Pathway的差异蛋白数目除以注释到该Pathway的所有鉴定到蛋白，该值越大，说明注释到该Pathway差异蛋白比例越大。图中圆点大小代表注释到该Pathway的差异蛋白的数目。

图15 Pathway关系网络图

灰色表示差异蛋白。紫色球表示富集前十的Pathway，深色表示显著富集，浅色表示富集但是不显著，面积越大表示富集程度越高。不同颜色线条表示Pathway的不同分类，红色表示细胞过程(Cellular Processes)、蓝色表示环境信息处理(Environmental Information Processing)、绿色表示遗传信息处理(Genetic Information Processing)、紫色表示人类疾病（Human Diseasea）（仅限动物）、橙色表示代谢(Metabolism)、黄色表示有机系统(Organismal Systems)、褐色表示药物开发（Drug Development）。（通过网页图可以自由选择或者调整位置。）

（6）差异磷酸化蛋白的KOG注释

    差异蛋白KOG注释是将各比较组差异蛋白注释到的条目单独提取出来，并绘制柱状图来展示，可以更清楚的了解差异蛋白对应的功能分类。

图16 异蛋白KOG注释柱状图

x轴表示差异蛋白数目，y轴表示KOG条目。

（7）差异磷酸化蛋白互作分析

    蛋白之间通常通过相互作用结合成复合物之后行使相应的功能。通过与STRING蛋白互作数据库比对，对差异表达蛋白进行互作分析，并且取可信度前100的互作关系绘制了网络互作图。

图17 差异蛋白互作关系网络图

红色表示差异蛋白，圈的大小表示关系密集程度。

（8）差异磷酸化蛋白亚细胞定位

    蛋白质在核糖体中合成后经蛋白质分选信号引导后被转运到特定的细胞器中，部分蛋白质则被分泌到细胞外或留在细胞质中，只有转运到正确的部位才能参与细胞的各种生命活动。蛋白质的亚细胞定位是蛋白功能注释的重要部分。

图18 差异蛋白亚细胞定位柱状图

x轴代表亚细胞结构条目，y轴代表差异蛋白数目。

（9）磷酸化位点Motif分析

     Motif是比较有特征的短序列，会多次出现的，并被假设拥有生物学功能。而且，经常是一些具有序列特异性的蛋白的结合位点（如转录因子）或者是涉及到重要生物过程。

图19 Motif演示结果

（10）激酶-底物分析

      ⼈基因组注释信息告诉我们，⼈类存有518个激酶，主要分为9个组：AGC（蛋白激酶A、G、C组）、Atypical（非典型组）、CAMK（钙调节激酶组）、CK1（酪蛋白激酶组）、CMGC（蛋白激酶CDK, MAPK, GSK3、CLK组）、STE（酵母STE7、11、20同源基因激酶组）、TK（酪氨酸激酶组）、TKL（类酪氨酸激酶组）和其他，90个家族、145个亚族。不同家族偏向有不⼀样的功能。

图20 ⼈类激酶组

表1 组织类样品送样要求

表2 蛋白类样品送样要求

Q1：磷酸化位点是如何确定的？

A1：一种特定的翻译后修饰通常会作用于一定的氨基酸，经修饰后，这一类氨基酸会增加相同的分子量，如，磷酸化肽段因加入磷酸化基团而产生+80的质量偏移。基于质量偏移的理论，利用生物信息学方法可以分析质谱数据鉴定磷酸化翻译后修饰。

Q2：磷酸化蛋白质组富集策略有哪些？如何选择？

A2: 对于磷酸化蛋白的分离富集

1）抗体富集法：就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀,从复杂混合物中免疫沉淀目标蛋白质，是最简单的方法；

2）激酶特异富集法：利用小分子的磷酸激酶抑制剂对其进行特异亲和层析成为激酶磷酸化蛋白质组学研究的重要方法；

3）亲和富集法：利用磷酸基团与一些金属离子或金属氧化物等的亲和作用,实现对磷酸化蛋白的富集。

对于磷酸化肽段的分离富集

1）化学修饰富集法：用亲和试剂取代磷酸化肽段上的磷酸集团, 再用亲和提取的方法从混合肽段中分离磷酸化肽段, 是一种有效的化学修饰法；

2）色谱分离富集法：包括IMAC富集法、金属氧化物（如TiO2等）和金属氢氧化物富集方法、阴阳离子交换富集法以及亲水性相互作用色谱法等；

3）MALDI靶盘富集法：为了满足对磷酸化蛋白的高通量分析以及微量样品的分析, 可以采用在线富集后直接质谱鉴定的方法。利用MALDI靶盘可实现直接在线富集检测。

据文献报道酪氨酸磷酸化比例最少，仅占整体磷酸化肽段的1%，如果实验目的只关注酪氨酸磷酸化的变化时，建议选择酪氨酸磷酸化抗体进行富集。如果实验关注的是非酪氨酸，或者是所有可以发生磷酸化的氨基酸（丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸），由于抗丝、苏氨酸磷酸化抗体抗原决定簇较小，使得抗原抗体的结合位点村长空间障碍，特异性较差，所以建议选择IMAC或TiO2富集。

Q3：华大科技用于磷酸化富集的方法是什么？

A3：华大科技选用的是TiO2富集法，它是目前最为成熟的金属氧化物磷酸化肽富集法TiO2在不同的pH值下，可以表现为路易斯酸或路易斯碱。在酸性条件下，钛原子带正电表现为路易斯酸，可以与阴离子结合；在碱性条件下，则表现为路易斯碱，可以与阳离子结合。这样磷酸化肽段的磷酸基在酸性条件下与之结合，碱性条件下洗脱，达到富集磷酸化肽段的目的。