1、用靶向高分辨率质谱法对人类磷酸化蛋白质组学进行即插即用分析。

Plug-and-play analysis of the human phosphoproteome by targeted high-resolution mass spectrometry. Nat. Methods. 2016

研究背景：研究细胞信号的系统方法要求磷酸化蛋白质组学技术能够在多个重复、条件和时间点上测量相同的磷酸化多肽。

实验样本：MCF7乳腺癌细胞

信息分析：Skyline20、Comet21、DIA-Umpire24

质谱仪：Q-Exactive Plus

实验结果：

图1 一种用于靶向人类磷蛋白分析的数据库

a：数据分析路径(在线方法)和汇总统计；b：单次试验(n = 388)与深度分馏实验(n = 50)中确定的磷酸化肽段比较；c：磷酸化肽段在实验中的重复性；d：卵裂形式特异性(最常见的卵裂状态/总计数)和分布；e：电荷状态特异性(最常见的电荷状态/总计数)和分布。

图2 即插即用分析展示

a：保留时间预测的性能；b：磷酸化肽段序列(n = 100)和电荷状态(n = 50)选择性能；c：PRM、DIA和DDA对IGF-1 EGF过矾酸钠处理的MCF7细胞中纯化的磷酸化肽段101个靶点的分析；d：对T308 / T309和S473 / S474(n = 6)靶向位点特异性和异构形式特异性定量AKT1/2磷酸化。

2、酪氨酸磷酸化分析用于肉瘤细胞系研究

Phosphoproteomic profiling reveals ALK and MET as novel actionable targets across synovial sarcoma subtypes. Cancer Res. 2017

研究背景：尽管肉瘤有多种治疗方式，但从结缔组织中产生的恶性肿瘤依然具备很多亚种，生存率极低。

技术手段：文章采用基于质谱的磷酸化蛋白全谱的方法，对迄今为止最大种类最多的肉瘤细胞系进行表征，鉴定到新的酪氨酸磷酸化形式，在特殊的亚型中酪氨酸激酶活性增强，作为驱动激酶可作为治疗的候选靶点。

实验样品：尤文氏肉瘤（ES），血管肉瘤（AS），滑膜肉瘤（SS），横纹肌肉瘤（RMS），胃肠道间质瘤（GIST）细胞系；20mg；

质谱仪：Thermo Fisher Scientific Orbitrap Plus ；Maxquant

实验结果：得到1090个酪氨酸磷酸化肽段，654个蛋白；基于酪氨酸磷酸化全谱，通过无监督的聚类分析，细胞系分为3大类；

图3 肉瘤细胞系的酪氨酸磷酸化分析

A：基于酪氨酸磷酸化模式的肉瘤细胞系无监督分层聚类；B：蛋白质-蛋白质网络分析子群A揭示PTK2 (FAK)作为关键介质；C：使用酪氨酸激酶衍生的磷酸化多肽无监督分层聚类。

图4 酪氨酸激酶在肉瘤细胞系中的酪氨酸磷酸化

A：个别酪氨酸激酶对总磷酸化多肽丰度的贡献；B：肉瘤细胞系中特异性TKs的磷酸化展示；C：SS细胞系中ALK表达和磷酸化。

3、人类细胞蛋白组学乙酰化全谱

Proteome-wide acetylationdynamics in human cells. Sci Reprots. 2017

研究背景：蛋白质乙酰化在调控蛋白功能和特性方面起到重要作用，研究乙酰化的动态范围有助于了解修饰对蛋白稳定性、定位和功能的影响。

研究思路：

图5 代谢标记和工作流程

实验样品：Hela加入13C葡萄糖、D3-醋酸盐培养取8个时间点（0.5, 1, 4, 8, 12, 16, and 24 hours）

质谱仪：Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer

实验结果：通过该平台，对大约1000个位点进行了表征，根据乙酰化速率聚集鉴定出这些位点的乙酰化趋势显著增加。

表1 乙酰化鉴定数

图6 重乙酰化聚类趋势

A：热图显示每一个时间点上13C/(13C+12C)的比例，在13C-葡萄糖标记的实验中有统计学意义的重乙酰化；B：热图显示每一个时间点上的13C/(13C+12C)比例，在D3-醋酸盐标记实验中有统计学意义的重乙酰化作用。

4、首次基于全细胞蛋白质组和赖氨酸乙酰化对红色毛藓菌菌丝和分生孢子阶段的比较。

The first whole-cell proteome- and lysine-acetylome-based comparison between Trichophyton rubrum conidial and mycelial stages. J. Proteome Res. 2018

研究背景：红色毛藓菌作为最常见的真菌病原体及皮肤真菌感染研究最多的模式菌，但是目前所有的抗菌治疗对其作用仍不是很明显。

技术手段：该研究通过对红色毛藓菌两个生命阶段蛋白质组及乙酰化蛋白全谱进行对比，分析出两个时期的差异蛋白进而鉴定表征出其生理差异，为后续靶向治疗提供理论参考依据。

研究思路：

图7 红色毛藓菌赖氨酸乙酰化研究流程

实验样品：红色毛藓菌菌丝和分生孢子

信息分析： MaxQuant

质谱仪：Q ExactiveTM

实验结果： 两个时期蛋白质组总共鉴定出4343个蛋白，其中有1879个差异蛋白；分生孢子期鉴定出386个修饰位点，285个蛋白，菌丝期鉴定出5414个修饰位点，2335个蛋白。

图8 GO丰富蛋白在全细胞蛋白质组分析

A：分生孢子特定蛋白GO富集；B：菌丝特定蛋白GO富集；C：差异表达蛋白GO富集。

图9 基于KEGG富集的乙酰化和琥珀酰化修饰的关系热图

颜色代表每种类型的通道的富集(红色)或耗尽(绿色)。

5、人血清中可溶性Fcγ受体Ⅲb的位点特异性N-糖基化分析。

Site-specific N-glycosylation analysis of soluble Fcγ receptor Ⅲb in human serum. Sci Rep 2018

研究背景：Fcγ受体在免疫系统中为免疫球蛋白G调节着各种效应及调控机制，N-糖基化的Fcγ受体很大程度的影响着免疫系统的功能。尽管已有研究报导描述重组FcγRⅢb糖蛋白的糖基化结构，但是关于其原有糖链异质体仍不是很了解。

技术手段：本研究基于质谱对一种从人体血清内纯化的FcγRⅢb的可溶性形态进行了位点特异性的N-糖基化分析。

研究思路：FcγRⅢb纯化——酶解富集糖肽——位点特异性糖基化质谱分析

实验样品：人类血清

信息分析： GlycoMod

质谱仪：Q ExactiveTM, Nanospray Flex Ion Source

实验结果：数据结果显示在每个N-糖基化位点的糖链异质体与之前所报导的重组FcγRⅢb糖蛋白具一致趋势，同时发现45号位天冬酰胺被高甘露糖类型低聚糖特异性占有。

图10 血清sFcγRⅢb位点特异性糖链异质体质谱图谱

覆盖6个N-糖基化位点，分别为(A) Asn38, (B) Asn45, (C) Asn64, (D) Asn74, (E) Asn162, and (F) Asn169。

表2 人血清sFc-RⅢb的N-糖基化位点的主要糖基形式

6、蛋白组学和泛素化蛋白全谱分析分析揭示了泛素化在矮牵牛花蛋白降解中的作用。

Proteomes and Ubiquitylomes Analysis Reveals the Involvement of Ubiquitination in Protein Degradation in Petunias. Plant Physiol. 2017

研究背景：花瓣衰老作为一个复杂的程序化过程，通过使用一种植物激素——乙烯进行处理便可引发衰老发生，这一过程能极大的改变植物中转录组及蛋白质组表达谱。但是，乙烯对后转录修饰或者泛素化在后转录修饰及蛋白质组的影响知之甚少。

技术手段：该研究首先通过RNA测序获得了矮牵牛花转录组数据，然后再定量经乙烯处理矮牵牛花花冠的蛋白质组、泛素化蛋白质全谱及两者之间的联系。

研究思路：

图11 经乙烯处理的矮牵牛花花冠全蛋白质组和泛素组的定量分析工作流程

实验样品：矮牵牛花

信息分析： GlycoMod

质谱仪：Q ExactiveTM, Nanospray Flex Ion Source

实验结果：经乙烯处理16个小时的矮牵牛花，鉴定出51799条功能基因，3606个蛋白以及2270个泛素化位点；其中14448下调基因6303上调基因，284下调233上调蛋白，320上调127下调泛素化位点。

图12 矮牵牛花所有赖氨酸泛素化位点分析图谱

A：泛素化序列及Kub保守位点；B：每个序列中包含泛素化赖氨酸所鉴定肽段数目；C：泛素化位点氨基酸性质；D：近Kub位点蛋白二级结构预测；E：在选择的真核生物中，泛素化和非泛素化的赖氨酸的进化保护。

图13 乙烯对矮牵牛花乙烯合成及信号转导路径中蛋白的影响

本研究中基于统计学意义的差异表达蛋白被框在椭圆形框中，而不同的泛素化和磷酸化蛋白质框在圆形框中。红色方框表示上调，绿色方框表示下调，而蓝色表示对乙烯的处理没有显著变化。

1、定性结果展示

（1） 对于鉴定到磷酸化肽段，本项目利用磷酸化位点鉴定phosphoRS>0.75进行过滤。对于真核生物，蛋白磷酸化通常会发生在丝氨酸（S）、苏氨酸（T）、酪氨酸（Y）上，其参与的生物学过程不太相同，发生比例也不一样。

图1 肽段磷酸化位点数分布（a）及磷酸化修饰氨基酸残基分布（b）

（2）磷酸化蛋白GO注释：

      Geno Ontology(简称GO)是一个国际标准化的基因功能分类系统，提供了一套动态更新的标准词汇表（Controlled Vocabulary)来全面描述生物体中基因和基因产物的属性。GO总共有三个本体（Ontology），分别描述基因的分子功能（Molecular Function）、细胞组成（Cellular Component）、参与的生物过程（Biological Process）。

图2 GO功能注释图

GO分类图显示了三个本体中所涉及到各条目的分布情况，不同颜色标记为三个本体中涉及到的各个条目。

（3）磷酸化蛋白COG注释

      COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins 蛋白相邻类的聚簇）是对蛋白质进行直系同源分类的数据库。构成每个COG的蛋白都是被假定为来自于一个祖先蛋白，并且是orthologs或者是paralogs.Orthologs是指来自于不同物种的由垂直家系（物种形成）进化而来的蛋白，并且特异地保留与原始蛋白相同的功能。Paralogs是那些在一定物种中的来源于基因复制的蛋白，可能会进化出新的与原来有关的功能。该分析将鉴定到的蛋白质和COG数据库进行比对，预测这些蛋白质可能的功能并对其做功能分类统计。

图3 COG注释柱图

纵坐标为COG分类条目，横坐标为功能分类对应的蛋白数量，该图表示样品中不同功能的蛋白质的统计数量。

（4）KEGG代谢通路注释分析

      在生物体内，不同蛋白相互协调行使其生物学行为，基于Pathway的分析有助于更进一步了解其生物学功能。KEGG是有关Pathway的主要公共数据库（Kanehisa，2008），通过Pathway分析能确定蛋白质参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。

  图4 Pathway Map

红框表明有鉴定到的蛋白在该节点发挥作用。

2、定量结果展示

（1）磷酸化蛋白组定量

      磷酸化肽段定量火山图。横轴为肽段定量值（log2化），纵轴为统计检验的P-value（-log化）；分布在该火山图左上右上两区域的肽段为显著差异肽段，既满足差异倍数大于1.5或小于2/3，又满足统计检验P-value值小于0.05。

图5 磷酸化肽段定量火山图

表1  差异磷酸化肽段数目统计

（2） 定量重复性评估

      变异系数（Coefficient of Variation）是衡量各观测值变异程度的一个统计量，其计算公式为：变异系数 C·V =（标准偏差SD/平均值Mean）× 100%；一般来说，CV值越高，其观测值离散程度越大，重复性却差；反之CV越小，离散程度越小， 重复性越好。该图中横轴为CV范围，10%表示CV在0~10%以内的部分， 20%表示CV在10%~20%以内的部分，以此类推。纵轴左侧单位具体肽段数目，右侧单位为比例。

图6 磷酸化肽段定量变异系数(CV)分布图

（3） motif分析

      ⼀类磷酸化激酶能对有相同序列的蛋白进行磷酸化。如AKT激酶能对"R--s"序列的蛋白进行磷酸化。利用motif-X进行修饰位点所在序列的motif提取，能推出蛋白对应的磷酸化激酶。

图7 某个磷酸化肽段motif图

（4）激酶-底物分析

      ⼈基因组注释信息告诉我们，⼈类存有518个激酶，主要分为9个组：AGC（蛋白激酶A、G、C组）、Atypical（非典型组）、CAMK（钙调节激酶组）、CK1（酪蛋白激酶组）、CMGC（蛋白激酶CDK, MAPK, GSK3、CLK组）、STE（酵母STE7、11、20同源基因激酶组）、TK（酪氨酸激酶组）、TKL（类酪氨酸激酶组）和其他，90个家族、145个亚族。不同家族偏向有不⼀样的功能。

图8 ⼈类激酶组

表1 组织类样品送样要求

表2 蛋白类样品送样要求

Q1：磷酸化位点是如何确定的？

A1：一种特定的翻译后修饰通常会作用于一定的氨基酸，经修饰后，这一类氨基酸会增加相同的分子量，如，磷酸化肽段因加入磷酸化基团而产生+80的质量偏移。基于质量偏移的理论，利用生物信息学方法可以分析质谱数据鉴定磷酸化翻译后修饰。

Q2：磷酸化蛋白质组富集策略有哪些？如何选择？

A2: 对于磷酸化蛋白的分离富集

1）抗体富集法：就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀,从复杂混合物中免疫沉淀目标蛋白质，是最简单的方法；

2）激酶特异富集法：利用小分子的磷酸激酶抑制剂对其进行特异亲和层析成为激酶磷酸化蛋白质组学研究的重要方法；

3）亲和富集法：利用磷酸基团与一些金属离子或金属氧化物等的亲和作用,实现对磷酸化蛋白的富集。

对于磷酸化肽段的分离富集

1）化学修饰富集法：用亲和试剂取代磷酸化肽段上的磷酸集团, 再用亲和提取的方法从混合肽段中分离磷酸化肽段, 是一种有效的化学修饰法；

2）色谱分离富集法：包括IMAC富集法、金属氧化物（如TiO2等）和金属氢氧化物富集方法、阴阳离子交换富集法以及亲水性相互作用色谱法等；

3）MALDI靶盘富集法：为了满足对磷酸化蛋白的高通量分析以及微量样品的分析, 可以采用在线富集后直接质谱鉴定的方法。利用MALDI靶盘可实现直接在线富集检测。

据文献报道酪氨酸磷酸化比例最少，仅占整体磷酸化肽段的1%，如果实验目的只关注酪氨酸磷酸化的变化时，建议选择酪氨酸磷酸化抗体进行富集。如果实验关注的是非酪氨酸，或者是所有可以发生磷酸化的氨基酸（丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸），由于抗丝、苏氨酸磷酸化抗体抗原决定簇较小，使得抗原抗体的结合位点村长空间障碍，特异性较差，所以建议选择IMAC或TiO2富集。

Q3：华大科技用于磷酸化富集的方法是什么？

A3：华大科技选用的是TiO2富集法，它是目前最为成熟的金属氧化物磷酸化肽富集法TiO2在不同的pH值下，可以表现为路易斯酸或路易斯碱。在酸性条件下，钛原子带正电表现为路易斯酸，可以与阴离子结合；在碱性条件下，则表现为路易斯碱，可以与阳离子结合。这样磷酸化肽段的磷酸基在酸性条件下与之结合，碱性条件下洗脱，达到富集磷酸化肽段的目的。