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目标蛋白定量分析
目标蛋白定量分析产品是指利用基于质谱的多反应检测技术（Multiple Reaction Monitoring, MRM）有目标地分析检测可能与特殊功能相关的关键蛋白在多样本中的表达量变化情况，进而推测这些蛋白的生物学功能的新型技术产品。
MRM技术作为一种高特异性、高灵敏度的质谱数据获取方式，在进行目标蛋白质组学的研究中发挥了重要作用，逐步受到更多的研究者们关注。该技术基于三重四级杆质谱仪，根据已知信息或假定信息设定检测规则，记录符合规则的离子信号，去除大量不符合规则的干扰信号，快速、高效地对数十个目标蛋白进行定性、定量分析。
图1 MRM工作原理
酶解后的肽段经过液相分离系统进入质谱仪进行检测。第一重四级杆（Quadrupole，Q1）只允许特定质荷比的肽段离子（parent ion，母离子）通过，第二重四级杆（Q2）诱导母离子碰撞得到肽段的碎片离子，第三重四级杆（Q3）只允许特定质荷比的碎片离子（fragment ion，子离子）通过，并且记录子离子信号。MRM技术通过母子离子对（transition）的选择，去除干扰离子，降低化学背景，提高物质定量灵敏度。
产品优势
- 通量高：一次上机检测，可同时得到数十种目标蛋白的定量信息。
- 周期短：无需抗体制备和Western Blotting实验过程，极大缩短了项目周期。
- 准确性高：通过对目标蛋白母子离子对的选择，去除干扰离子，靶向精确定量。
- 特异性高：避免抗体制备过程中引入的非特异性结合因素，高效筛选目标蛋白。
产品应用
- 大范围蛋白质组检测后的目标蛋白验证。
- 同源蛋白或突变蛋白定量研究。
- 开发临床诊断预测试剂盒。
技术路线
目标蛋白分析包括方法建立、目标蛋白检测、生物信息学分析三个部分。
信息分析内容
1、方法建立
1）目标蛋白总结
2）数据质控
3）MRM方法展示
2、样本检测
1）定量信息
2）数据归一化
3）目标蛋白相对定量
3、定制化信息分析
可结合客户的需求，协商确定定制化信息分析内容。
1、采用iTRAQ和MRM研究两种药物作用二型糖尿病分子机制
The serum protein responses to treatment with Xiaoke Pill and Glibenclamide in type 2 diabetes patients. Clinical Proteomics. 2017
背景：含有中药成分和格列本脲的消渴丸与格列本脲相比，不仅能够有效治疗糖尿病，还能显著降低低血糖症副作用的出现风险，但其作用机制尚不清楚。
方法思路：
图1方法思路
结果：
- 在49个差异蛋白中选择32个进行MRM验证，68%的蛋白与iTRAQ结果一致。
- 两种不同药物处理共有差异蛋白的比例34%远低于有无低血糖共有差异蛋白57%
图2 蛋白差异统计结果
两种药物处理后iTRAQ检测共49个蛋白差异表达，17个蛋白为两种药物共有差异蛋白，28个为有无低血糖两组共有差异蛋白。
主要结论：
1）两种抗糖尿病药物对于疾病的治疗是通过不同蛋白起作用的
2）血清中不存在低血糖的biomarker
3）与抗糖尿病药物相关的血清蛋白可能也参与了低血糖症状
2、研究大豆不同品种对害虫的耐受性
Proteomic analysis by iTRAQ-MRM of soybean resistance to Lamprosema Indicate. BMC Genomics.2017.
背景：豆卷叶野螟分布在中国各地，辽宁受害重。主要危害大豆、绿豆、菜豆、荨麻等作物。本课题将两个品种大豆（抵抗品种- Gantai-2-2（HR）和敏感品种- Wan 82–178（HS））的栽培暴露在豆卷叶野螟环境中（0h和48h），对差异蛋白质组进行研究（iTRAQ+MRM）。
研究思路：
实验：iTRAQ 8标，两个品种（HR和HS），2个时间点（0h和48h），2个生物学重复；MRM验证
主要发现：
0h和48h对比，HR和HS两个品种分别鉴定到31个和53个差异蛋白，在0h HR/HS的差异蛋白数是28。大多数的差异蛋白与核糖体亚油酸代谢、激素信号转导、黄酮的生物合成、抗性相关等代谢途径有关。
图3 每组差异蛋白做聚类图 图4 MRM验证
1、方法建立
1）目标蛋白总结
首先，利用高分辨质谱仪TripleTOF 5600 （SCIEX, Framingham, MA, USA）对样品进行蛋白鉴定，通过Mascot软件（Matrix Science，UK）结合使用相应物种蛋白数据库对质谱数据进行搜索和蛋白质鉴定。对于本展示项目37个目标蛋白，29 个蛋白具有鉴定图谱和唯一肽段。然后，利用QTRAP 5500质谱仪（SCIEX, Framingham, MA, USA）对这些肽段进行 MRM 方法验证。最终，建立了28 个蛋白质的 MRM 方法。
表1 目标蛋白信息总结（部分）
2）数据质控
建立一个目标蛋白的 MRM 质谱方法，需要有标准品指示目标蛋白在质谱检测的准确性。利用真实样品的目标蛋白质谱鉴定数据，可真实记录目标蛋白的出峰时间和鉴定证据。从目标蛋白中，挑选具有二级图谱信息支持的肽段，并确保该肽段对于目标蛋白是唯一肽段。利用Skyline软件，我们针对唯一肽段设置 MRM 方法，并使用QTRAP 5500质谱仪对 MRM 方法进行验证。
图1 MRM方法建立过程肽段数据示意图
左上，肽段鉴定谱图，展示唯一肽段的二级图谱信息；右上，肽段的碎片离子 MRM色谱图；左下，肽段碎片离子强度信息；右下，肽段预测保留时间与实际保留时间相关性。
3）MRM方法展示
本项目对28 个目标蛋白成功建立了 MRM 质谱方法。表2展示了每个蛋白每对 transition 的详细信息。
表2 目标蛋白MRM方法详细信息（部分）
2、样本检测
1）数据归一化
本项目利用外参蛋白β-galactosidase 的方法进行数据归一化，以降低MRM非标定量的实验误差。一般情况下，所有 transition 的信号都会用于目标蛋白的定量，但是如果发现个别 transition 由于背景干扰导致强度跟其他 transition 不一致，这些 transition 会去除。目标蛋白的每个 transition 的信号会通过β-galactosidase 的信号进行归一化。
图2 数据归一化过程
左图，目标蛋白每个肽段的色谱出峰时间误差，RT≤±2min；右图，目标蛋白所有transition归一化强度分布。
2）目标蛋白相对定量
在提取目标蛋白所有归一化强度后，本项目利用一个线性混合模型进行目标蛋白在样品中的相对定量，此模型整合在MSstats工具包中，该统计分析会给出蛋白在比较组的比值以及校正p值（ajusted p-value）。校正p值也反映原始统计检验的假阳性（Benjamini and Hochberg方法），目标蛋白在1.5倍差异且校正p值<0.05（假阳性<0.05）的条件下认为是差异蛋白。
图3 目标蛋白相对定量
左图，目标蛋白所有肽段质定量信息变异系数分布，一般认为80%的肽段CV<20%为数据质量好；右图，目标蛋白在所有比较组的相对定量分布，横坐标为比值取log2，纵坐标为校正p值取-log10，目标蛋白在1.5倍差异且校正p值<0.05的条件下认为是差异蛋白。
1、组织类样品送样要求
表1 组织类样品送样要求
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送样量 |
备注 |
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动物组织 |
≥100mg |
植物叶片≥0.5g；富含杂质或蛋白质含量低的样品量干重≥1g，如植物的根、木质部、韧皮部组织等 |
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植物、蕈类真菌（如蘑菇、木耳）、藻类 |
≥1g |
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酵母、霉菌类真菌和细菌、噬菌体等微生物 |
≥200mg（菌体约20μL） |
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新鲜培养细胞数(个) |
≥3~5×106（细胞沉淀体积 约30uL~50µL左右） |
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血液类 |
血清、血浆≥500µL；全血 ≥5mL |
解冻后血细胞会破裂，蛋白溶出来会影响分析，因此一般不建议送全血 |
2、蛋白类样品送样要求
表2 蛋白类样品送样要求
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蛋白 |
≥500μg，浓度≥1µg/µL |
Q1：只知道蛋白序列，MRM技术能否像Western blot技术一样精确的找到该蛋白并对它的量进行分析？
A1：有目标蛋白的序列信息，MRM是可以替代Western lot技术进行目标蛋白的精确定量，定性和差异分析。
Q2：MRM技术进行质谱时，可以一次监测多少个蛋白？是只能对一个特定蛋白监测，还是多个特定蛋白同时监测？
A2：主要根据蛋白丰度和样本基质的情况决定，不同样本不同蛋白的理化性质不一样，一般情况下，MRM可同时检测200对transition，预计是20－40个蛋白质。
Q3：如果不知道蛋白质的信息，能否进行MRM？若只有基因组的信息，能否进行？
A3：进行MRM必须明确知道目标蛋白质，并获得蛋白质的全序列；如果有基因组信息，一般都会有预测编码蛋白序列，可以先翻译成氨基酸序列再进行MRM。
Q4：母子离子对是怎样选择的？一个子离子是否会对应多个母离子，怎样保证特殊性？是否一定要有相关数据库的支持？
A4：母子离子对是通过LC-MS/MS产生的谱图库筛选，软件设定，并经过实验优化获得的；一个子离子可能对应多个母离子，可以通过MRM的全谱扫描分析出子离子唯一对应的母离子。最好要有相关的数据库支持，若没有，可以自行筛选，但是工作量可能较大。
Q5：什么时候进行母子离子对的设定？如何设定？
A5：母子离子对需要在样品进入质谱仪之前设定并调试好。先通过谱图库筛选到得到母子离子对，设定参数，进行质谱鉴定，若出现的谱图显示捕捉到目的肽段，那就可以适用，若不行，重新设定，这样不断的反复验证筛选获得最适的母子离子对。
Q6：MRM在做蛋白质定量方面有哪些优势？
A6：优异的定向性：去除背景噪音，定向研究目的蛋白；高通量：能实现大规模样本的定量分析；特异性好：无非特异性交叉反应；