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目标蛋白定量分析
目标蛋白定量分析产品是指利用基于质谱的多反应检测技术（Multiple Reaction Monitoring, MRM）有目标地分析检测可能与特殊功能相关的关键蛋白在多样本中的表达量变化情况，进而推测这些蛋白的生物学功能的新型技术产品。
MRM技术作为一种高特异性、高灵敏度的质谱数据获取方式，在进行目标蛋白质组学的研究中发挥了重要作用，逐步受到更多的研究者们关注。该技术基于三重四级杆质谱仪，根据已知信息或假定信息设定检测规则，记录符合规则的离子信号，去除大量不符合规则的干扰信号，快速、高效地对数十个目标蛋白进行定性、定量分析。
图1 MRM工作原理
酶解后的肽段经过液相分离系统进入质谱仪进行检测。第一重四级杆（Quadrupole，Q1）只允许特定质荷比的肽段离子（parent ion，母离子）通过，第二重四级杆（Q2）诱导母离子碰撞得到肽段的碎片离子，第三重四级杆（Q3）只允许特定质荷比的碎片离子（fragment ion，子离子）通过，并且记录子离子信号。MRM技术通过母子离子对（transition）的选择，去除干扰离子，降低化学背景，提高物质定量灵敏度。
产品优势
- 通量高：一次上机检测，可同时得到数十种目标蛋白的定量信息。
- 周期短：无需抗体制备和Western Blotting实验过程，极大缩短了项目周期。
- 准确性高：通过对目标蛋白母子离子对的选择，去除干扰离子，靶向精确定量。
- 特异性高：避免抗体制备过程中引入的非特异性结合因素，高效筛选目标蛋白。
产品应用
- 大范围蛋白质组检测后的目标蛋白验证。
- 同源蛋白或突变蛋白定量研究。
- 开发临床诊断预测试剂盒。
技术路线
目标蛋白分析包括方法建立、目标蛋白检测、生物信息学分析三个部分。
信息分析内容
1、方法建立
1）目标蛋白总结
2）数据质控
3）MRM方法展示
2、样本检测
1）定量信息
2）数据归一化
3）目标蛋白相对定量
3、定制化信息分析
可结合客户的需求，协商确定定制化信息分析内容。
1、iTRAQ+MRM研究抑郁症发病分子机制
Proteomic analysis reveals a biosignature of decreased synaptic protein in cerebrospinal fluid of major depressive disorder. Translational Psychiatry. 2020
背景： 重度抑郁症(MDD) 在欧洲的终生患病率为10%，严重影响社会生产力。它是一种使人衰弱的疾病，对个人和家庭生活有负面影响，如阿尔茨海默氏症、痴呆症和心血管疾病；此病容易反复发作，且对抗抑郁药物的抵抗力不断增强；重度抑郁症患者企图或实际自杀的发病率很高。同时MDD在病因学、症状表现、病程和治疗反应等方面都高度异质性。目前对此病的病理生理学认识仍不完整。
研究思路：
采用蛋白质组学研究中经典的发现+验证的一站式思路进行研究，样品类型为脑脊液，各阶段选取的样本如下表
表1 选取样本分组情况
组别 | MDD（重度抑郁症） | BI（双相情感障碍） | SCZ（精神分裂症） | CON（正常对照） |
iTRAQ发现阶段 | 12 | 6 | 6 | 14 |
MRM验证阶段 | 40 | 11 | 13 | 27 |
主要结果：
（1）iTRAQ分析表明，MDD脑脊液中突触传递、髓鞘化和Wnt信号等相关蛋白表达量存在显著改变。
图1 显著差异蛋白火山图
（2）MRM验证分析证实，与对照组相比，MDD患者脑脊液中包括膜突触蛋白neurexin 3 (NRXN3)、接触相关蛋白样4 (CNTNAP4)和谷氨酸离子转化受体AMPA型亚基4 (GRIA4)在内的8种蛋白水平明显下降。
图2 MRM验证
（3）该研究初步证实了构成MDD生物特征的蛋白质，并为了解MDD和其他精神疾病的病理生理学提供了见解。
2、iTRAQ+MRM研究蝴蝶兰花芽低温诱导下早期发育分子机制
Proteomic Analysis of the Early Development of the Phalaenopsis amabilis Flower Bud under Low Temperature Induction Using the iTRAQ/MRM Approach. Molecules. 2020
背景：蝴蝶兰拥有优美的外形和艳丽的花朵，是国际花卉市场上最重要的植物之一。它是一种经过春化的兰花，需要低温处理才能开花。而关于蝴蝶兰花芽发育的分子机制尚不清晰，相关蛋白质组学研究也很少。
研究思路：iTRAQ发现，CK对照、T10（低温处理10天），T20（低温处理20天）共三组蝴蝶兰的花蕾组织，每组2例生物学重复；MRM验证
主要结果：
（1）通过iTRAQ技术在低温处理的蝴蝶兰中发现5064个差异表达蛋白，其中42个差异蛋白与光周期、春化途径、激素途径、碳代谢、能量代谢和应激反应相关。
图3 显著差异蛋白pathway富集
（2）与春化途径相关的蛋白质，PEQU_11434和PEQU_19304上调且通过MRM技术得到验证。
图4 MRM验证蛋白列表
（3）推测O-GlcNAc糖基化参与VRN1的转录后修饰，GRP2蛋白(富含甘氨酸的RNA结合蛋白)糖基化减轻其与VRN1前体mRNA的结合，促进VRN1的表达和开花。春化后，VRN1表达增加，VRN2介导抑制释放出VRN3，VRN3表达增加，刺激VRN1高表达，并通过与FDL2(开花位点)蛋白相互作用促进开花。通过功能分析推测出低温诱导下蝴蝶兰花芽早期发育的调控网络。
图5 推测的早期花芽分化调控网络
1、方法建立
1）目标蛋白总结
首先，利用高分辨质谱仪TripleTOF 5600 （SCIEX, Framingham, MA, USA）对样品进行蛋白鉴定，通过Mascot软件（Matrix Science，UK）结合使用相应物种蛋白数据库对质谱数据进行搜索和蛋白质鉴定。对于本展示项目37个目标蛋白，29 个蛋白具有鉴定图谱和唯一肽段。然后，利用QTRAP 5500质谱仪（SCIEX, Framingham, MA, USA）对这些肽段进行 MRM 方法验证。最终，建立了28 个蛋白质的 MRM 方法。
表1 目标蛋白信息总结（部分）
2）数据质控
建立一个目标蛋白的 MRM 质谱方法，需要有标准品指示目标蛋白在质谱检测的准确性。利用真实样品的目标蛋白质谱鉴定数据，可真实记录目标蛋白的出峰时间和鉴定证据。从目标蛋白中，挑选具有二级图谱信息支持的肽段，并确保该肽段对于目标蛋白是唯一肽段。利用Skyline软件，我们针对唯一肽段设置 MRM 方法，并使用QTRAP 5500质谱仪对 MRM 方法进行验证。
图1 MRM方法建立过程肽段数据示意图
左上，肽段鉴定谱图，展示唯一肽段的二级图谱信息；右上，肽段的碎片离子 MRM色谱图；左下，肽段碎片离子强度信息；右下，肽段预测保留时间与实际保留时间相关性。
3）MRM方法展示
本项目对28 个目标蛋白成功建立了 MRM 质谱方法。表2展示了每个蛋白每对 transition 的详细信息。
表2 目标蛋白MRM方法详细信息（部分）
2、样本检测
1）数据归一化
本项目利用外参蛋白β-galactosidase 的方法进行数据归一化，以降低MRM非标定量的实验误差。一般情况下，所有 transition 的信号都会用于目标蛋白的定量，但是如果发现个别 transition 由于背景干扰导致强度跟其他 transition 不一致，这些 transition 会去除。目标蛋白的每个 transition 的信号会通过β-galactosidase 的信号进行归一化。
图2 数据归一化过程
左图，目标蛋白每个肽段的色谱出峰时间误差，RT≤±2min；右图，目标蛋白所有transition归一化强度分布。
2）目标蛋白相对定量
在提取目标蛋白所有归一化强度后，本项目利用一个线性混合模型进行目标蛋白在样品中的相对定量，此模型整合在MSstats工具包中，该统计分析会给出蛋白在比较组的比值以及校正p值（ajusted p-value）。校正p值也反映原始统计检验的假阳性（Benjamini and Hochberg方法），目标蛋白在1.5倍差异且校正p值<0.05（假阳性<0.05）的条件下认为是差异蛋白。
图3 目标蛋白相对定量
左图，目标蛋白所有肽段质定量信息变异系数分布，一般认为80%的肽段CV<20%为数据质量好；右图，目标蛋白在所有比较组的相对定量分布，横坐标为比值取log2，纵坐标为校正p值取-log10，目标蛋白在1.5倍差异且校正p值<0.05的条件下认为是差异蛋白。
1、组织类样品送样要求
表1 组织类样品送样要求
| 样品类型 | 送样量 | 备注 |
| 新鲜动物组织干重 | ≥10mg | 富含杂质或蛋白质含量低的样品量干重≥5g，如植物的根、木质部、韧皮部组织等 |
| 植物、蕈类真菌（如蘑菇、木耳）类 样品量湿重 |
≥300mg | |
| 酵母、霉菌类真菌和细菌、噬菌体等微生物 | ≥50mg，或细胞数≥5×106 | |
| 新鲜培养细胞数(个) | ≥1×107（细胞沉淀体积约30μl~50μl左右） | |
| 客户分离好的外泌体 | ≥50μg，浓度≥0.5μg/μL | |
| 血液类（去高丰度） | 血清、血浆≥200µL | 解冻后血细胞会破裂，蛋白溶出来会影响分析，因此一般不建议送全血 |
2、蛋白类样品送样要求
表2 蛋白类样品送样要求
|
蛋白 |
≥100μg，浓度≥0.5µg/µL |
Q1：只知道蛋白序列，MRM技术能否像Western blot技术一样精确的找到该蛋白并对它的量进行分析？
A1：有目标蛋白的序列信息，MRM是可以替代Western lot技术进行目标蛋白的精确定量，定性和差异分析。
Q2：MRM技术进行质谱时，可以一次监测多少个蛋白？是只能对一个特定蛋白监测，还是多个特定蛋白同时监测？
A2：主要根据蛋白丰度和样本基质的情况决定，不同样本不同蛋白的理化性质不一样，一般情况下，MRM可同时检测200对transition，预计是20－40个蛋白质。
Q3：如果不知道蛋白质的信息，能否进行MRM？若只有基因组的信息，能否进行？
A3：进行MRM必须明确知道目标蛋白质，并获得蛋白质的全序列；如果有基因组信息，一般都会有预测编码蛋白序列，可以先翻译成氨基酸序列再进行MRM。
Q4：母子离子对是怎样选择的？一个子离子是否会对应多个母离子，怎样保证特殊性？是否一定要有相关数据库的支持？
A4：母子离子对是通过LC-MS/MS产生的谱图库筛选，软件设定，并经过实验优化获得的；一个子离子可能对应多个母离子，可以通过MRM的全谱扫描分析出子离子唯一对应的母离子。最好要有相关的数据库支持，若没有，可以自行筛选，但是工作量可能较大。
Q5：什么时候进行母子离子对的设定？如何设定？
A5：母子离子对需要在样品进入质谱仪之前设定并调试好。先通过谱图库筛选到得到母子离子对，设定参数，进行质谱鉴定，若出现的谱图显示捕捉到目的肽段，那就可以适用，若不行，重新设定，这样不断的反复验证筛选获得最适的母子离子对。
Q6：MRM在做蛋白质定量方面有哪些优势？
A6：优异的定向性：去除背景噪音，定向研究目的蛋白；高通量：能实现大规模样本的定量分析；特异性好：无非特异性交叉反应。
