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高通量单细胞免疫组库
产品概述
利用10X Genomics单细胞免疫组库技术，可实现对单个细胞，同时进行基因表达和适应性免疫受体库进行研究，为免疫组学研究提供更具扩展性的平台。基于10X Genomics平台，一次性能够分离500~10000个单细胞，利用5'端接头的通用引物和免疫分子恒定区的巢式引物进行V(D)J富集，并可以同时测定同一细胞的TCR、B细胞免疫球蛋白和5’基因表达，获得单个T细胞TCR的α链和β链的配对序列信息，单个B细胞的重链和轻链免疫球蛋白（Ig）配对序列，以及基因表达等信息，揭示免疫细胞的复杂性，有助于在传染病、自身免疫性疾病、免疫疗法开发和癌症研究中获得切实可行的深入见解。
应用领域
抗体的鉴定和新抗体的发现：获得特征性的BCR序列，缩短抗体开发流程。
自身免疫疾病：分析异常表达的免疫细胞，寻找生物标记物。
癌症早期检测：癌症进程和复发诊断的标记物以及肿瘤免疫机制的研究。
用药及疫苗评估：针对某种疾病用药后的外周血样本进行评估，确认药物是否激发免疫反应及其功效。
产品优势
项目经验丰富：华大基因成立至今，单细胞服务业务国内首家，合作伙伴遍布全球，多项科研成果在顶尖杂志上发表，累计IF＞150。
产品技术先进：可实现成对的重链和轻链（B细胞）或α和β链（T细胞）的全长测序及配对信息。
信息分析内容前沿：生信分析全新升级，采用较新的分析软件，克隆多态性多维度分析。
多组学联合研究：克隆型多态性定位到转录组数据分析得到的细胞群体，体现免疫细胞在群体中状态。
一站式单细胞研究服务：提供流式分选服务，实现免疫细胞目的分选，一站式实现从组织到数据，避免细胞反复冻融。
研究流程
利用液滴法的原理，使用GemCode技术，通过控制微流体的进入，将带有barcode、UMI（Unique Molecular Index，分子标签）、引物及酶的凝胶珠（Gel Beads）与单细胞混合，从而实现大规模的单细胞分离。随后凝胶株破乳，释放出的cDNA可分做两份或三份，一份可进行5’RACE mRNA基因表达定量文库构建，另一份或两份可用于免疫组库文库构建。在构建免疫组库文库过程中，TCR或者BCR的V(D)J序列可以通过设计一或更多的巢式PCR引物对TCR或者BCR、lg的C区域进行富集；构建完整的的5’RACE mRNA文库结构以及TCR/BCR文库结构。随后通过高通量测序，即可一次性获得大量单细胞的基因表达和免疫组库数据。
图1 实验流程图
测序策略
测序平台：MGISEQ-2000平台
测序读长（5’ RACE mRNA-Seq文库）：建议PE100，1条lane
测序读长（TCR/BCR文库）：建议PE150；各0.5条lane
信息分析
表1 5' RACE mRNA-Seq文库信息分析内容列表
信息分析条款 | 信息分析内容 |
标准信息分析 （需要基于良好的参考序列， 且每个样本拆分出的细胞数目上下浮动在20%， 或以内的误差皆属于正常范围） | 1. 测序结果统计 2. 数据质控统计 3. 比对结果统计 4. 基因表达定量分析 5. Marker基因鉴定 6. 细胞类型注释 7. 单样本/多样本细胞聚类分析 8. 特异marker基因差异分析 9. 样本间相同cluster基因差异分析 10. cluster差异表达基因GO功能分析 11. cluster差异表达基因Pathway功能分析 12. cluster差异表达基因TF编码能力预测 13. cluster差异表达基因蛋白互作分析 14. cluster基因相关性网络分析 |
高级信息分析 | 细胞轨迹分析(仅选取时间点样本可选做） |
定制化信息分析 | 可结合客户的需求，协商确定定制化信息分析内容 |
表2 TCR/BCR文库信息分析内容列表
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信息分析条款 |
信息分析内容 |
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标准信息分析 （需要基于良好的参考序列， 且每个样本拆分出的细胞数目上下浮动在20%或以内的误差皆属于正常范围） |
1. CDR3序列鉴定 2. 克隆型鉴定及注释 3. 克隆型多样性分析 4. 多样本克隆型比较分析 5. 克隆型序列及V-J组合分析 6. 克隆型进化分析 7. 克隆型在细胞类群分布统计 |
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定制化信息分析 |
可结合客户的需求，协商确定定制化信息分析内容 |
免疫机制研究——单细胞免疫组库研究肿瘤免疫疗法诱发肠炎反应的分子机制
文章： Molecular pathways of colon inflammation induced by cancer immunotherapy
杂志： Cell
研究思路：
通过比较正常人和使用CTLA-4和PD-1抑制剂免疫治疗的黑色素瘤病人的单细胞测序数据，发现了肿瘤免疫疗法引发肠炎反应副作用的可能机制。
研究方案设计：
样本/细胞类型：正常对照人群（Control），患有黑色素瘤并经过免疫治疗后没有引发肠道炎性反应的病人（+CPI no colitis），以及有诱发肠道炎性反应的病人（+CPI colitis）结肠粘膜，流式细胞分选富集到的CD45+ 单核细胞和CD3+ T 细胞。
样本数：8个产生肠炎反应的黑色素瘤病人，8个正常人，6个无肠道炎性反应黑色素瘤病人
图1 实验设计思路图
主要结果展示：
1. 有和无肠道炎性反应病人较大的差异在T细胞群体的差异
本次研究，通过对CD45+免疫细胞分选，共获得51,652个细胞，通过对所有样本中CD45+免疫细胞的分析，发现Control组和+CPI no colitis组具有非常相似的转录组图谱，而在+CPI colitis组却能观察到非常显著的T细胞和骨髓细胞（myeloid cell）富集情况，因此该结果表明肠道内某些免疫细胞组成的变化与有诱发肠道炎性反应（+CPI colitis）的产生具有很强的相关性（见图2）。
图2 细胞类型型比对差异统计
2. 免疫克隆型分析T细胞分化可能来源
方法：通过TCR的序列信息来分析+CPI colitis相关的T细胞类型产生的原因以及细胞之间的分化轨迹。
结果：基于TCR的数据分析表明，在+CPI colitis 样本的CD8+ T细胞中，94.2%的增殖T细胞与毒性T细胞具有相同的TCR序列信息(见图3A-C)，这说明在这两种细胞类型之间存在明显的动态转变关系，且相当一部分肠炎相关毒性T细胞和增殖T细胞来源于组织常驻记忆T细胞（tissue-resident memory T cells，Trm），这解释了为什么治疗开始后肠炎症状往往迅速出现。
图3 CD8+ T细胞细胞毒性和增殖计划的结肠相关变化
(A)所有受试者(每组6-8例患者)从CD3+数据集中选择的CD8 T细胞亚聚类新方法
【1】Luoma A M, Suo S, Williams H L, et al. Molecular pathways of colon inflammation induced by cancer immunotherapy[J]. Cell, 2020, 182(3): 655-671. e22.
1. chao1评估样本克隆型多样性
2. 稀疏曲线评估样本克隆型多样性
3. 克隆类型在不同链型（TCR的α/β链等）中占比统计
4. Tracking评估样本克隆型变化趋势
5. 不同克隆型频率在细胞聚类中的分布图
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细胞状态 |
细胞直径<40μm；细胞活性>80%；细胞浓度>5×105/ml |
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细胞悬液背景干净，无大量结团、碎片及杂质，不含Ca2+和Mg2+ |
Q1：冻存细胞/组织样本寄送前有哪些注意事项？
需要提前与当地销售经理沟通，提前告知邮寄到样时间，加快实验进程以及确保细胞样本活性。
Q2：癌症组织样本可以协助解离服务和上门建库服务吗？
可以进行癌症组织样本组织解离服务和上门建库服务。
Q3：华大提供的10X Genomics单细胞免疫组库产品是否可以只进行一种文库类型的建库？
10X Genomics单细胞免疫组库产品建库部分可分为TCR/BCR文库、TCR+BCR文库、TCR/BCR+5’mRNA文库、TCR+BCR+5’mRNA文库几种组合类型，客户可以根据自身研究需求选择所需的建库类型。
